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Méthodes d'essais toxicologiques

Dimanche, Janvier 16 2011 18: 45

Biomarqueurs

Le mot biomarqueur est l'abréviation de marqueur biologique, un terme qui fait référence à un événement mesurable se produisant dans un système biologique, tel que le corps humain. Cet événement est alors interprété comme le reflet, ou le marqueur, d'un état plus général de l'organisme ou de l'espérance de vie. En santé au travail, un biomarqueur est généralement utilisé comme indicateur de l'état de santé ou du risque de maladie.

Les biomarqueurs sont utilisés pour des études in vitro et in vivo qui peuvent inclure des humains. Habituellement, trois types spécifiques de marqueurs biologiques sont identifiés. Bien que quelques biomarqueurs puissent être difficiles à classer, ils sont généralement séparés en biomarqueurs d'exposition, biomarqueurs d'effet ou biomarqueurs de sensibilité (voir tableau 1).

Tableau 1. Exemples de biomarqueurs d'exposition ou biomarqueurs d'effet utilisés dans les études toxicologiques en santé au travail

Échantillon Mesure Objectif
Biomarqueurs d'exposition
Tissu adipeux dioxine Exposition aux dioxines
sanguins Plomb Exposition au plomb
Greffe Osseuse Aluminium Exposition à l'aluminium
Souffle expiré Toluène Exposition au toluène
Implants Mercury Exposition au méthylmercure
Sérum Benzène Exposition au benzène
Urine Phénol Exposition au benzène
Biomarqueurs d'effet
sanguins Carboxyhémoglobine Exposition au monoxyde de carbone
des globules rouges Zinc-protoporphyrine Exposition au plomb
Sérum Cholinestérase Exposition aux organophosphorés
Urine Microglobulines Exposition néphrotoxique
Les globules blancs Adduits à l'ADN Exposition mutagène

 

Avec un degré de validité acceptable, les biomarqueurs peuvent être utilisés à plusieurs fins. Sur une base individuelle, un biomarqueur peut être utilisé pour étayer ou réfuter un diagnostic d'un type particulier d'empoisonnement ou d'un autre effet indésirable d'origine chimique. Chez un sujet sain, un biomarqueur peut également refléter l'hypersensibilité individuelle à des expositions chimiques spécifiques et peut donc servir de base pour la prédiction des risques et le conseil. Dans les groupes de travailleurs exposés, certains biomarqueurs d'exposition peuvent être appliqués pour évaluer le degré de conformité aux réglementations antipollution ou l'efficacité des efforts de prévention en général.

Biomarqueurs d'exposition

Un biomarqueur d'exposition peut être un composé exogène (ou un métabolite) dans le corps, un produit interactif entre le composé (ou le métabolite) et un composant endogène, ou un autre événement lié à l'exposition. Le plus souvent, les biomarqueurs des expositions à des composés stables, tels que les métaux, comprennent des mesures des concentrations de métaux dans des échantillons appropriés, tels que le sang, le sérum ou l'urine. Avec les produits chimiques volatils, leur concentration dans l'air expiré (après inhalation d'air non contaminé) peut être évaluée. Si le composé est métabolisé dans l'organisme, un ou plusieurs métabolites peuvent être choisis comme biomarqueur de l'exposition ; les métabolites sont souvent déterminés dans des échantillons d'urine.

Les méthodes modernes d'analyse peuvent permettre la séparation d'isomères ou de congénères de composés organiques et la détermination de la spéciation de composés métalliques ou des rapports isotopiques de certains éléments. Des analyses sophistiquées permettent de déterminer les changements dans la structure de l'ADN ou d'autres macromolécules provoqués par la liaison avec des produits chimiques réactifs. Ces techniques avancées gagneront sans aucun doute considérablement en importance pour les applications dans les études de biomarqueurs, et des limites de détection plus basses et une meilleure validité analytique rendront probablement ces biomarqueurs encore plus utiles.

Des développements particulièrement prometteurs ont eu lieu avec des biomarqueurs d'exposition à des produits chimiques mutagènes. Ces composés sont réactifs et peuvent former des adduits avec des macromolécules, telles que des protéines ou de l'ADN. Des adduits d'ADN peuvent être détectés dans les globules blancs ou des biopsies tissulaires, et des fragments d'ADN spécifiques peuvent être excrétés dans l'urine. Par exemple, l'exposition à l'oxyde d'éthylène entraîne des réactions avec les bases de l'ADN et, après excision de la base endommagée, la N-7-(2-hydroxyéthyl)guanine sera éliminée dans les urines. Certains adduits peuvent ne pas se référer directement à une exposition particulière. Par exemple, la 8-hydroxy-2´-désoxyguanosine reflète les dommages oxydatifs de l'ADN, et cette réaction peut être déclenchée par plusieurs composés chimiques, dont la plupart induisent également une peroxydation lipidique.

D'autres macromolécules peuvent également être modifiées par formation d'adduits ou oxydation. D'un intérêt particulier, de tels composés réactifs peuvent générer des adduits d'hémoglobine qui peuvent être déterminés en tant que biomarqueurs d'exposition aux composés. L'avantage est que de grandes quantités d'hémoglobine peuvent être obtenues à partir d'un échantillon de sang et, étant donné la durée de vie de quatre mois des globules rouges, les adduits formés avec les acides aminés de la protéine indiqueront l'exposition totale pendant cette période.

Les adduits peuvent être déterminés par des techniques sensibles telles que la chromatographie lipidique à haute performance, et certaines méthodes immunologiques sont également disponibles. En général, les méthodes analytiques sont nouvelles, coûteuses et nécessitent un développement et une validation supplémentaires. Une meilleure sensibilité peut être obtenue en utilisant le 32Test de post-marquage P, qui est une indication non spécifique que des dommages à l'ADN ont eu lieu. Toutes ces techniques sont potentiellement utiles pour la surveillance biologique et ont été appliquées dans un nombre croissant d'études. Cependant, des méthodes analytiques plus simples et plus sensibles sont nécessaires. Compte tenu de la spécificité limitée de certaines méthodes à de faibles niveaux d'exposition, le tabagisme ou d'autres facteurs peuvent avoir un impact significatif sur les résultats de mesure, entraînant ainsi des difficultés d'interprétation.

L'exposition à des composés mutagènes ou à des composés qui sont métabolisés en mutagènes peut également être déterminée en évaluant la mutagénicité de l'urine d'un individu exposé. L'échantillon d'urine est incubé avec une souche de bactéries dans laquelle une mutation ponctuelle spécifique est exprimée d'une manière qui peut être facilement mesurée. Si des produits chimiques mutagènes sont présents dans l'échantillon d'urine, un taux accru de mutations se produira dans les bactéries.

Les biomarqueurs d'exposition doivent être évalués au regard de la variation temporelle de l'exposition et de la relation aux différents compartiments. Ainsi, la ou les périodes de temps représentées par le biomarqueur, c'est-à-dire la mesure dans laquelle la mesure du biomarqueur reflète l'exposition ou les expositions passées et/ou la charge corporelle accumulée, doivent être déterminées à partir des données toxicocinétiques afin d'interpréter le résultat. En particulier, le degré auquel le biomarqueur indique une rétention dans des organes cibles spécifiques doit être pris en compte. Bien que les échantillons de sang soient souvent utilisés pour les études de biomarqueurs, le sang périphérique n'est généralement pas considéré comme un compartiment en tant que tel, bien qu'il agisse comme un milieu de transport entre les compartiments. La mesure dans laquelle la concentration dans le sang reflète les niveaux dans différents organes varie considérablement entre les différents produits chimiques et dépend généralement aussi de la durée de l'exposition ainsi que du temps écoulé depuis l'exposition.

Parfois, ce type de preuve est utilisé pour classer un biomarqueur comme un indicateur de dose absorbée (totale) ou un indicateur de dose efficace (c'est-à-dire la quantité qui a atteint le tissu cible). Par exemple, l'exposition à un solvant particulier peut être évaluée à partir de données sur la concentration réelle du solvant dans le sang à un moment particulier après l'exposition. Cette mesure reflétera la quantité de solvant qui a été absorbée par le corps. Une partie de la quantité absorbée sera expirée en raison de la pression de vapeur du solvant. En circulant dans le sang, le solvant interagira avec divers composants du corps et finira par être dégradé par les enzymes. Le résultat des processus métaboliques peut être évalué en déterminant des acides mercapturiques spécifiques produits par conjugaison avec le glutathion. L'excrétion cumulée des acides mercapturiques peut mieux refléter la dose efficace que la concentration sanguine.

Les événements de la vie, tels que la reproduction et la sénescence, peuvent affecter la distribution d'un produit chimique. La distribution des produits chimiques dans le corps est considérablement affectée par la grossesse, et de nombreux produits chimiques peuvent traverser la barrière placentaire, provoquant ainsi une exposition du fœtus. La lactation peut entraîner l'excrétion de produits chimiques liposolubles, entraînant ainsi une diminution de la rétention chez la mère ainsi qu'une augmentation de l'absorption par le nourrisson. Pendant la perte de poids ou le développement de l'ostéoporose, des produits chimiques stockés peuvent être libérés, ce qui peut alors entraîner une exposition «endogène» renouvelée et prolongée des organes cibles. D'autres facteurs peuvent affecter l'absorption individuelle, le métabolisme, la rétention et la distribution des composés chimiques, et certains biomarqueurs de sensibilité sont disponibles (voir ci-dessous).

Biomarqueurs d'effet

Un marqueur d'effet peut être un composant endogène, ou une mesure de la capacité fonctionnelle, ou un autre indicateur de l'état ou de l'équilibre du corps ou du système organique, tel qu'affecté par l'exposition. De tels marqueurs d'effets sont généralement des indicateurs précliniques d'anomalies.

Ces biomarqueurs peuvent être spécifiques ou non spécifiques. Les biomarqueurs spécifiques sont utiles car ils indiquent un effet biologique d'une exposition particulière, fournissant ainsi des preuves qui peuvent potentiellement être utilisées à des fins préventives. Les biomarqueurs non spécifiques n'indiquent pas une cause individuelle de l'effet, mais ils peuvent refléter l'effet total intégré dû à une exposition mixte. Les deux types de biomarqueurs peuvent donc être d'une utilité considérable en santé au travail.

Il n'y a pas de distinction claire entre les biomarqueurs d'exposition et les biomarqueurs d'effet. Par exemple, on pourrait dire que la formation d'adduits reflète un effet plutôt que l'exposition. Cependant, les biomarqueurs d'effet indiquent généralement des changements dans les fonctions des cellules, des tissus ou de l'ensemble du corps. Certains chercheurs incluent des changements brutaux, tels qu'une augmentation du poids du foie des animaux de laboratoire exposés ou une diminution de la croissance chez les enfants, comme biomarqueurs d'effet. Aux fins de la santé au travail, les biomarqueurs d'effets devraient être limités à ceux qui indiquent des modifications biochimiques subcliniques ou réversibles, telles que l'inhibition des enzymes. Le biomarqueur d'effet le plus fréquemment utilisé est probablement l'inhibition de la cholinestérase causée par certains insecticides, c'est-à-dire les organophosphorés et les carbamates. Dans la plupart des cas, cet effet est entièrement réversible et l'inhibition enzymatique reflète l'exposition totale à ce groupe particulier d'insecticides.

Certaines expositions n'entraînent pas d'inhibition enzymatique mais plutôt une activité accrue d'une enzyme. C'est le cas de plusieurs enzymes appartenant à la famille P450 (voir « Déterminants génétiques de la réponse toxique »). Ils peuvent être induits par des expositions à certains solvants et hydrocarbures polyaromatiques (HAP). Étant donné que ces enzymes sont principalement exprimées dans les tissus à partir desquels une biopsie peut être difficile à obtenir, l'activité enzymatique est déterminée indirectement in vivo en administrant un composé qui est métabolisé par cette enzyme particulière, puis le produit de dégradation est mesuré dans l'urine ou le plasma.

D'autres expositions peuvent induire la synthèse d'une protéine protectrice dans l'organisme. Le meilleur exemple est probablement la métallothionéine, qui lie le cadmium et favorise l'excrétion de ce métal ; l'exposition au cadmium est l'un des facteurs qui entraînent une expression accrue du gène de la métallothionéine. Des protéines protectrices similaires peuvent exister mais n'ont pas encore été suffisamment explorées pour être acceptées comme biomarqueurs. Parmi les candidats à une utilisation possible en tant que biomarqueurs figurent les protéines dites de stress, appelées à l'origine protéines de choc thermique. Ces protéines sont générées par une gamme d'organismes différents en réponse à une variété d'expositions nocives.

Les dommages oxydatifs peuvent être évalués en déterminant la concentration de malondialdéhyde dans le sérum ou l'exhalation d'éthane. De même, l'excrétion urinaire de protéines de faible poids moléculaire, comme l'albumine, peut être utilisée comme biomarqueur d'une atteinte rénale précoce. Plusieurs paramètres couramment utilisés en pratique clinique (par exemple, les taux sériques d'hormones ou d'enzymes) peuvent également être utiles en tant que biomarqueurs. Cependant, bon nombre de ces paramètres peuvent ne pas être suffisamment sensibles pour détecter une déficience précoce.

Un autre groupe de paramètres d'effet concerne les effets génotoxiques (modifications de la structure des chromosomes). De tels effets peuvent être détectés par microscopie des globules blancs qui subissent une division cellulaire. De graves dommages aux chromosomes - aberrations chromosomiques ou formation de micronoyaux - peuvent être observés au microscope. Les dommages peuvent également être révélés en ajoutant un colorant aux cellules lors de la division cellulaire. L'exposition à un agent génotoxique peut alors être visualisée comme un échange accru du colorant entre les deux chromatides de chaque chromosome (échange de chromatides sœurs). Les aberrations chromosomiques sont liées à un risque accru de développer un cancer, mais la signification d'un taux accru d'échange de chromatides sœurs est moins claire.

Une évaluation plus sophistiquée de la génotoxicité est basée sur des mutations ponctuelles particulières dans les cellules somatiques, c'est-à-dire les globules blancs ou les cellules épithéliales obtenues à partir de la muqueuse buccale. Une mutation à un locus spécifique peut rendre les cellules capables de se développer dans une culture contenant un produit chimique autrement toxique (comme la 6-thioguanine). En variante, un produit génique spécifique peut être évalué (par exemple, des concentrations sériques ou tissulaires d'oncoprotéines codées par des oncogènes particuliers). De toute évidence, ces mutations reflètent le total des dommages génotoxiques subis et n'indiquent pas nécessairement quoi que ce soit sur l'exposition causale. Ces méthodes ne sont pas encore prêtes pour une utilisation pratique en médecine du travail, mais des progrès rapides dans cette ligne de recherche suggèrent que de telles méthodes deviendront disponibles d'ici quelques années.

Biomarqueurs de susceptibilité

Un marqueur de susceptibilité, qu'il soit héréditaire ou induit, est un indicateur que l'individu est particulièrement sensible à l'effet d'un xénobiotique ou aux effets d'un groupe de tels composés. La plus grande attention a été portée sur la susceptibilité génétique, bien que d'autres facteurs puissent être au moins aussi importants. L'hypersensibilité peut être due à un trait héréditaire, à la constitution de l'individu ou à des facteurs environnementaux.

La capacité à métaboliser certains produits chimiques est variable et déterminée génétiquement (voir « Déterminants génétiques de la réponse toxique »). Plusieurs enzymes pertinentes semblent être contrôlées par un seul gène. Par exemple, l'oxydation de produits chimiques étrangers est principalement réalisée par une famille d'enzymes appartenant à la famille P450. D'autres enzymes rendent les métabolites plus solubles dans l'eau par conjugaison (par exemple, N-acétyltransférase et μ-glutathion-S-transférase). L'activité de ces enzymes est contrôlée génétiquement et varie considérablement. Comme mentionné ci-dessus, l'activité peut être déterminée en administrant une petite dose d'un médicament, puis en déterminant la quantité du métabolite dans l'urine. Certains des gènes ont maintenant été caractérisés et des techniques sont disponibles pour déterminer le génotype. Des études importantes suggèrent qu'un risque de développer certaines formes de cancer est lié à la capacité de métaboliser des composés étrangers. De nombreuses questions restent encore en suspens, ce qui limite à ce jour l'utilisation de ces potentiels biomarqueurs de susceptibilité en santé au travail.

D'autres traits hérités, tels que l'alpha1-le déficit en antitrypsine ou déficit en glucose-6-phosphate déshydrogénase, entraînent également des mécanismes de défense déficients dans l'organisme, provoquant ainsi une hypersensibilité à certaines expositions.

La plupart des recherches liées à la susceptibilité ont porté sur la prédisposition génétique. D'autres facteurs jouent également un rôle et ont été en partie négligés. Par exemple, les personnes atteintes d'une maladie chronique peuvent être plus sensibles à une exposition professionnelle. De plus, si un processus pathologique ou une exposition antérieure à des produits chimiques toxiques a causé des dommages subcliniques aux organes, la capacité de résister à une nouvelle exposition toxique est susceptible d'être moindre. Des indicateurs biochimiques du fonctionnement des organes peuvent dans ce cas être utilisés comme biomarqueurs de susceptibilité. Le meilleur exemple concernant l'hypersensibilité concerne peut-être les réactions allergiques. Si un individu est devenu sensibilisé à une exposition particulière, des anticorps spécifiques peuvent être détectés dans le sérum. Même si l'individu n'a pas été sensibilisé, d'autres expositions actuelles ou passées peuvent augmenter le risque de développer un effet indésirable lié à une exposition professionnelle.

Un problème majeur est de déterminer l'effet conjoint des expositions mixtes au travail. De plus, les habitudes personnelles et la consommation de drogues peuvent entraîner une sensibilité accrue. Par exemple, la fumée de tabac contient généralement une quantité considérable de cadmium. Ainsi, avec une exposition professionnelle au cadmium, un gros fumeur qui a accumulé des quantités substantielles de ce métal dans le corps sera plus à risque de développer une maladie rénale liée au cadmium.

Application en santé au travail

Les biomarqueurs sont extrêmement utiles dans la recherche toxicologique et nombre d'entre eux peuvent s'appliquer à la surveillance biologique. Néanmoins, les limites doivent également être reconnues. De nombreux biomarqueurs n'ont jusqu'à présent été étudiés que sur des animaux de laboratoire. Les schémas toxicocinétiques chez d'autres espèces ne reflètent pas nécessairement la situation chez les êtres humains, et l'extrapolation peut nécessiter des études de confirmation chez des volontaires humains. Il faut également tenir compte des variations individuelles dues à des facteurs génétiques ou constitutionnels.

Dans certains cas, les biomarqueurs d'exposition peuvent ne pas être réalisables du tout (par exemple, pour les produits chimiques à courte durée de vie in vivo). D'autres produits chimiques peuvent être stockés dans des organes auxquels il n'est pas possible d'accéder par des procédures de routine, tels que le système nerveux, ou les affecter. La voie d'exposition peut également affecter le schéma de distribution et donc également la mesure du biomarqueur et son interprétation. Par exemple, une exposition directe du cerveau via le nerf olfactif est susceptible d'échapper à la détection par la mesure des biomarqueurs d'exposition. Quant aux biomarqueurs d'effet, beaucoup d'entre eux ne sont pas du tout spécifiques et le changement peut être dû à diverses causes, y compris des facteurs liés au mode de vie. Peut-être en particulier avec les biomarqueurs de sensibilité, l'interprétation doit être très prudente pour le moment, car de nombreuses incertitudes subsistent quant à l'importance globale pour la santé des génotypes individuels.

En santé au travail, le biomarqueur idéal doit répondre à plusieurs exigences. Tout d'abord, le prélèvement et l'analyse des échantillons doivent être simples et fiables. Pour une qualité analytique optimale, une normalisation est nécessaire, mais les exigences spécifiques varient considérablement. Les principaux domaines de préoccupation comprennent : la préparation de l'individu, la procédure d'échantillonnage et la manipulation des échantillons, et la procédure de mesure ; ce dernier englobe des facteurs techniques, tels que les procédures d'étalonnage et d'assurance qualité, et des facteurs liés à l'individu, tels que l'éducation et la formation des opérateurs.

Pour la documentation de la validité analytique et de la traçabilité, les matériaux de référence doivent être basés sur des matrices pertinentes et avec des concentrations appropriées de substances toxiques ou de métabolites pertinents à des niveaux appropriés. Pour que les biomarqueurs soient utilisés pour la surveillance biologique ou à des fins de diagnostic, les laboratoires responsables doivent disposer de procédures analytiques bien documentées avec des caractéristiques de performance définies et des enregistrements accessibles pour permettre la vérification des résultats. Dans le même temps, néanmoins, les aspects économiques de la caractérisation et de l'utilisation de matériaux de référence pour compléter les procédures d'assurance qualité en général doivent être pris en compte. Ainsi, la qualité réalisable des résultats et les utilisations qui en sont faites doivent être mises en balance avec les coûts supplémentaires de l'assurance qualité, y compris les matériaux de référence, la main-d'œuvre et l'instrumentation.

Une autre exigence est que le biomarqueur doit être spécifique, au moins dans les circonstances de l'étude, pour un type particulier d'exposition, avec une relation claire avec le degré d'exposition. Sinon, le résultat de la mesure du biomarqueur peut être trop difficile à interpréter. Pour une interprétation correcte du résultat de mesure d'un biomarqueur d'exposition, la validité diagnostique doit être connue (c'est-à-dire la traduction de la valeur du biomarqueur en ampleur des risques possibles pour la santé). Dans ce domaine, les métaux servent de paradigme pour la recherche de biomarqueurs. Des recherches récentes ont démontré la complexité et la subtilité des relations dose-réponse, avec des difficultés considérables pour identifier les niveaux sans effet et donc aussi pour définir les expositions tolérables. Cependant, ce type de recherche a également illustré les types d'enquête et le raffinement qui sont nécessaires pour découvrir les informations pertinentes. Pour la plupart des composés organiques, les associations quantitatives entre les expositions et les effets nocifs correspondants sur la santé ne sont pas encore disponibles ; dans de nombreux cas, même les principaux organes cibles ne sont pas connus avec certitude. De plus, l'évaluation des données de toxicité et des concentrations de biomarqueurs est souvent compliquée par l'exposition à des mélanges de substances, plutôt que par l'exposition à un seul composé à la fois.

Avant que le biomarqueur ne soit appliqué à des fins de santé au travail, certaines considérations supplémentaires sont nécessaires. Premièrement, le biomarqueur doit refléter uniquement un changement subclinique et réversible. Deuxièmement, étant donné que les résultats des biomarqueurs peuvent être interprétés en fonction des risques pour la santé, des efforts de prévention doivent être disponibles et doivent être considérés comme réalistes au cas où les données des biomarqueurs suggèrent la nécessité de réduire l'exposition. Troisièmement, l'utilisation pratique du biomarqueur doit être généralement considérée comme éthiquement acceptable.

Les mesures d'hygiène industrielle peuvent être comparées aux limites d'exposition applicables. De même, les résultats sur les biomarqueurs d'exposition ou les biomarqueurs d'effet peuvent être comparés à des limites d'action biologique, parfois appelées indices d'exposition biologique. Ces limites devraient être fondées sur les meilleurs conseils des cliniciens et des scientifiques des disciplines appropriées, et les administrateurs responsables en tant que « gestionnaires des risques » devraient alors tenir compte des facteurs éthiques, sociaux, culturels et économiques pertinents. La base scientifique devrait, si possible, inclure des relations dose-réponse complétées par des informations sur les variations de sensibilité au sein de la population à risque. Dans certains pays, les travailleurs et les membres du grand public sont impliqués dans le processus de normalisation et apportent une contribution importante, en particulier lorsque l'incertitude scientifique est considérable. L'une des principales incertitudes est de savoir comment définir un effet nocif sur la santé qui devrait être évité, par exemple, si la formation d'adduits en tant que biomarqueur d'exposition représente en soi un effet nocif (c'est-à-dire un biomarqueur d'effet) qui devrait être prévenu. Des questions difficiles sont susceptibles de se poser lorsqu'il s'agit de décider s'il est éthiquement défendable, pour un même composé, d'avoir des limites différentes pour l'exposition fortuite, d'une part, et l'exposition professionnelle, d'autre part.

Les informations générées par l'utilisation des biomarqueurs doivent généralement être transmises aux personnes examinées dans le cadre de la relation médecin-patient. Les préoccupations éthiques doivent notamment être prises en compte dans le cadre d'analyses de biomarqueurs très expérimentales qui ne peuvent actuellement être interprétées en détail en termes de risques réels pour la santé. Pour la population générale, par exemple, il existe actuellement peu d'orientations concernant l'interprétation des biomarqueurs d'exposition autres que la plombémie. La confiance dans les données générées est également importante (c'est-à-dire si un échantillonnage approprié a été effectué et si de bonnes procédures d'assurance qualité ont été utilisées dans le laboratoire concerné). Un domaine supplémentaire d'inquiétude particulière concerne l'hypersensibilité individuelle. Ces questions doivent être prises en compte lors de la restitution de l'étude.

Tous les secteurs de la société concernés par ou concernés par la réalisation d'une étude de biomarqueurs doivent être impliqués dans le processus de prise de décision sur la manière de traiter les informations générées par l'étude. Des procédures spécifiques pour prévenir ou surmonter les conflits éthiques inévitables doivent être développées dans les cadres juridiques et sociaux de la région ou du pays. Cependant, chaque situation représente un ensemble différent de questions et de pièges, et aucune procédure unique de participation du public ne peut être développée pour couvrir toutes les applications des biomarqueurs d'exposition.

 

Noir

Dimanche, Janvier 16 2011 18: 49

Évaluation de la toxicité génétique

L'évaluation de la toxicité génétique est l'évaluation des agents pour leur capacité à induire l'un des trois types généraux de changements (mutations) dans le matériel génétique (ADN) : gène, chromosomique et génomique. Dans des organismes tels que les humains, les gènes sont composés d'ADN, qui se compose d'unités individuelles appelées bases nucléotidiques. Les gènes sont disposés dans des structures physiques discrètes appelées chromosomes. La génotoxicité peut entraîner des effets importants et irréversibles sur la santé humaine. Les dommages génotoxiques sont une étape critique dans l'induction du cancer et peuvent également être impliqués dans l'induction de malformations congénitales et de mort fœtale. Les trois classes de mutations mentionnées ci-dessus peuvent se produire dans l'un ou l'autre des deux types de tissus possédés par des organismes tels que les humains : les spermatozoïdes ou les ovules (cellules germinales) et le tissu restant (cellules somatiques).

Les tests qui mesurent la mutation génique sont ceux qui détectent la substitution, l'addition ou la suppression de nucléotides dans un gène. Les tests qui mesurent la mutation chromosomique sont ceux qui détectent les cassures ou les réarrangements chromosomiques impliquant un ou plusieurs chromosomes. Les tests qui mesurent la mutation génomique sont ceux qui détectent les changements dans le nombre de chromosomes, une condition appelée aneuploïdie. L'évaluation de la toxicité génétique a considérablement évolué depuis la mise au point par Herman Muller en 1927 du premier test de détection d'agents génotoxiques (mutagènes). Depuis lors, plus de 200 tests ont été développés pour mesurer les mutations de l'ADN ; cependant, moins de dix tests sont couramment utilisés aujourd'hui pour l'évaluation de la toxicité génétique. Cet article passe en revue ces essais, décrit ce qu'ils mesurent et explore le rôle de ces essais dans l'évaluation de la toxicité.

Identification des risques de cancerAvant le développement du Domaine de la toxicologie génétique

La toxicologie génétique est devenue une partie intégrante du processus global d'évaluation des risques et s'est récemment imposée comme un prédicteur fiable de l'activité cancérigène. Cependant, avant le développement de la toxicologie génétique (avant 1970), d'autres méthodes étaient et sont toujours utilisées pour identifier les risques potentiels de cancer chez l'homme. Il existe six grandes catégories de méthodes actuellement utilisées pour identifier les risques de cancer chez l'homme : les études épidémiologiques, les bioessais in vivo à long terme, les bioessais in vivo à moyen terme, les bioessais in vivo et in vitro à court terme, l'intelligence artificielle (structure-activité), et l'inférence basée sur le mécanisme.

Le tableau 1 donne les avantages et les inconvénients de ces méthodes.

Tableau 1. Avantages et inconvénients des méthodes actuelles d'identification des risques de cancer chez l'homme

  Avantages Inconvénients
Les études épidémiologiques (1) les humains sont les indicateurs ultimes de la maladie ;
(2) évaluer les populations sensibles ou sensibles ;
(3) cohortes d'exposition professionnelle; (4) alertes sentinelles environnementales
(1) généralement rétrospectif (certificats de décès, biais de rappel, etc.) ; (2) insensible, coûteux, long ; (3) des données d'exposition fiables parfois indisponibles ou difficiles à obtenir ; (4) expositions combinées, multiples et complexes; manque de cohortes de contrôle appropriées; (5) les expériences sur les humains ne sont pas faites ; (6) détection du cancer, pas prévention
Essais biologiques in vivo à long terme (1) évaluations prospectives et rétrospectives (validation) ; (2) excellente corrélation avec les carcinogènes humains identifiés; (3) niveaux et conditions d'exposition connus; (4) identifie la toxicité chimique et les effets cancérigènes ; (5) des résultats obtenus assez rapidement ; (6) comparaisons qualitatives entre classes chimiques; (7) systèmes biologiques intégratifs et interactifs étroitement liés aux humains (1) rarement reproduit, gourmand en ressources ; (3) des installations limitées adaptées à de telles expériences ; (4) débat sur l'extrapolation des espèces; (5) les expositions utilisées sont souvent à des niveaux bien supérieurs à ceux subis par les humains; (6) l'exposition à un seul produit chimique n'imite pas les expositions humaines, qui sont généralement à plusieurs produits chimiques simultanément
Essais biologiques in vivo et in vitro à moyen et court terme (1) plus rapide et moins cher que les autres tests ; (2) de grands échantillons facilement reproductibles ;
(3) les points limites biologiquement significatifs sont mesurés (mutation, etc.); (4) peuvent être utilisés comme essais de dépistage pour sélectionner des produits chimiques pour des essais biologiques à long terme
(1) in vitro pas entièrement prédictif d'in vivo; (2) généralement spécifiques à un organisme ou à un organe ; (3) puissances non comparables à des animaux entiers ou à des humains
Associations structure chimique–activité biologique (1) relativement facile, rapide et peu coûteux ; (2) fiable pour certaines classes chimiques (par exemple, les colorants nitrosamines et benzidine); (3) développé à partir de données biologiques mais non dépendant d'expérimentations biologiques supplémentaires (1) non « biologique » ; (2) de nombreuses exceptions aux règles formulées; (3) rétrospective et rarement (mais devenant) prospective
Inférences basées sur le mécanisme (1) raisonnablement précis pour certaines classes de produits chimiques ; (2) permet d'affiner les hypothèses ; (3) peut orienter les évaluations des risques vers les populations sensibles (1) mécanismes de carcinogenèse chimique indéfinis, multiples et probablement chimiques ou spécifiques à une classe ; (2) peut ne pas mettre en évidence les exceptions aux mécanismes généraux

 

Justification et fondement conceptuel des tests de toxicologie génétique

Bien que les types et le nombre exacts de tests utilisés pour l'évaluation de la toxicité génétique évoluent constamment et varient d'un pays à l'autre, les plus courants incluent des tests pour (1) la mutation génique dans les bactéries et/ou les cellules de mammifères cultivées et (2) la mutation chromosomique dans des cellules de mammifères cultivées et/ou de la moelle osseuse chez des souris vivantes. Certains des tests de cette deuxième catégorie peuvent également détecter l'aneuploïdie. Bien que ces tests ne détectent pas les mutations dans les cellules germinales, ils sont principalement utilisés en raison du coût supplémentaire et de la complexité de la réalisation des tests sur les cellules germinales. Néanmoins, les tests sur les cellules germinales chez la souris sont utilisés lorsque des informations sur les effets sur les cellules germinales sont souhaitées.

Des études systématiques sur une période de 25 ans (1970-1995), en particulier au US National Toxicology Program en Caroline du Nord, ont abouti à l'utilisation d'un nombre discret de tests pour détecter l'activité mutagène des agents. La raison d'être de l'évaluation de l'utilité des tests reposait sur leur capacité à détecter des agents qui causent le cancer chez les rongeurs et qui sont soupçonnés de causer le cancer chez l'homme (c.-à-d., des agents cancérigènes). En effet, des études menées au cours des dernières décennies ont indiqué que les cellules cancéreuses contiennent des mutations dans certains gènes et que de nombreux agents cancérigènes sont également mutagènes. Ainsi, les cellules cancéreuses sont considérées comme contenant des mutations des cellules somatiques et la carcinogenèse est considérée comme un type de mutagenèse des cellules somatiques.

Les tests de toxicité génétique les plus couramment utilisés aujourd'hui ont été sélectionnés non seulement en raison de leur grande base de données, de leur coût relativement faible et de leur facilité d'exécution, mais aussi parce qu'il a été démontré qu'ils détectent de nombreux cancérogènes chez les rongeurs et, par présomption, chez l'homme. Par conséquent, des tests de toxicité génétique sont utilisés pour prédire la cancérogénicité potentielle des agents.

Un développement conceptuel et pratique important dans le domaine de la toxicologie génétique a été la reconnaissance que de nombreux cancérogènes étaient modifiés par des enzymes dans le corps, créant des formes altérées (métabolites) qui étaient souvent la forme cancérigène et mutagène ultime de la substance chimique mère. Pour dupliquer ce métabolisme dans une boîte de Pétri, Heinrich Malling a montré que l'inclusion d'une préparation de foie de rongeur contenait de nombreuses enzymes nécessaires pour effectuer cette conversion ou activation métabolique. Ainsi, de nombreux tests de toxicité génétique effectués dans des boîtes ou des tubes (in vitro) emploient l'addition de préparations enzymatiques similaires. Les préparations simples sont appelées mélange S9 et les préparations purifiées sont appelées microsomes. Certaines cellules bactériennes et mammifères ont maintenant été génétiquement modifiées pour contenir certains des gènes de rongeurs ou d'humains qui produisent ces enzymes, réduisant ainsi la nécessité d'ajouter un mélange S9 ou des microsomes.

Dosages et techniques de toxicologie génétique

Les principaux systèmes bactériens utilisés pour le dépistage de la toxicité génétique sont le test de mutagénicité de Salmonella (Ames) et, dans une bien moindre mesure, la souche WP2 de Escherichia coli. Des études menées au milieu des années 1980 ont indiqué que l'utilisation de seulement deux souches du système Salmonella (TA98 et TA100) était suffisante pour détecter environ 90 % des mutagènes connus de Salmonella. Ainsi, ces deux souches sont utilisées pour la plupart des objectifs de dépistage ; cependant, diverses autres souches sont disponibles pour des tests plus approfondis.

Ces dosages sont effectués de diverses manières, mais deux procédures générales sont les dosages d'incorporation sur plaque et de suspension liquide. Dans le test d'incorporation sur plaque, les cellules, le produit chimique d'essai et (le cas échéant) le S9 sont ajoutés ensemble dans une gélose liquéfiée et versés sur la surface d'une boîte de Pétri d'agar. La gélose supérieure durcit en quelques minutes et les plaques sont incubées pendant deux à trois jours, après quoi les cellules mutantes se sont développées pour former des amas de cellules détectables visuellement appelées colonies, qui sont ensuite comptées. Le milieu gélosé contient des agents sélectifs ou est composé d'ingrédients tels que seules les cellules nouvellement mutées se développeront. Le test d'incubation liquide est similaire, sauf que les cellules, l'agent de test et S9 sont incubés ensemble dans un liquide qui ne contient pas d'agar liquéfié, puis les cellules sont lavées sans l'agent de test et S9 et ensemencées sur l'agar.

Les mutations dans les cellules de mammifères en culture sont principalement détectées dans l'un des deux gènes suivants : hprt et de tk. Comme pour les tests bactériens, les lignées cellulaires de mammifères (développées à partir de cellules de rongeurs ou humaines) sont exposées à l'agent de test dans des boîtes ou des tubes de culture en plastique, puis sont ensemencées dans des boîtes de culture contenant un milieu avec un agent sélectif qui permet uniquement aux cellules mutantes de se développer. . Les tests utilisés à cette fin comprennent le CHO/HPRT, le TK6 et le lymphome de souris L5178Y/TK+/- dosages. D'autres lignées cellulaires contenant diverses mutations de réparation de l'ADN ainsi que certains gènes humains impliqués dans le métabolisme sont également utilisées. Ces systèmes permettent la récupération de mutations au sein du gène (mutation génique) ainsi que de mutations impliquant des régions du chromosome flanquant le gène (mutation chromosomique). Cependant, ce dernier type de mutation est beaucoup plus récupéré par la tk systèmes de gènes que par le hprt systèmes de gènes en raison de l'emplacement du tk .

Semblable au test d'incubation liquide pour la mutagénicité bactérienne, les tests de mutagénicité sur les cellules de mammifères impliquent généralement l'exposition des cellules dans des boîtes ou des tubes de culture en présence de l'agent de test et de S9 pendant plusieurs heures. Les cellules sont ensuite lavées, cultivées pendant plusieurs jours supplémentaires pour permettre la dégradation des produits géniques normaux (de type sauvage) et l'expression et l'accumulation des produits géniques nouvellement mutants, puis elles sont ensemencées dans un milieu contenant un agent sélectif qui permet seules les cellules mutantes se développent. Comme les tests bactériens, les cellules mutantes se développent en colonies visuellement détectables qui sont ensuite comptées.

La mutation chromosomique est identifiée principalement par des tests cytogénétiques, qui impliquent d'exposer des rongeurs et/ou des cellules de rongeurs ou humaines dans des boîtes de culture à un produit chimique d'essai, permettant à une ou plusieurs divisions cellulaires de se produire, de colorer les chromosomes, puis d'examiner visuellement les chromosomes au microscope. détecter des altérations de la structure ou du nombre de chromosomes. Bien qu'une variété de paramètres puissent être examinés, les deux qui sont actuellement acceptés par les organismes de réglementation comme étant les plus significatifs sont les aberrations chromosomiques et une sous-catégorie appelée micronoyaux.

Une formation et une expertise considérables sont nécessaires pour évaluer la présence d'aberrations chromosomiques dans les cellules, ce qui en fait une procédure coûteuse en temps et en argent. En revanche, les micronoyaux nécessitent peu de formation et leur détection peut être automatisée. Les micronoyaux apparaissent sous forme de petits points dans la cellule qui sont distincts du noyau, qui contient les chromosomes. Les micronoyaux résultent soit d'une rupture chromosomique, soit d'une aneuploïdie. En raison de la facilité de notation des micronoyaux par rapport aux aberrations chromosomiques, et parce que des études récentes indiquent que les agents qui induisent des aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse des souris vivantes induisent généralement des micronoyaux dans ce tissu, les micronoyaux sont maintenant couramment mesurés comme une indication de la capacité d'un agent pour induire la mutation chromosomique.

Bien que les tests sur les cellules germinales soient utilisés beaucoup moins fréquemment que les autres tests décrits ci-dessus, ils sont indispensables pour déterminer si un agent présente un risque pour les cellules germinales, dont les mutations peuvent entraîner des effets sur la santé des générations suivantes. Les tests de cellules germinales les plus couramment utilisés sont chez la souris et impliquent des systèmes qui détectent (1) les translocations héréditaires (échanges) entre les chromosomes (test de translocation héréditaire), (2) les mutations génétiques ou chromosomiques impliquant des gènes spécifiques (locus visible ou biochimique spécifique). tests) et (3) les mutations qui affectent la viabilité (dosage létal dominant). Comme pour les tests sur les cellules somatiques, l'hypothèse de travail avec les tests sur les cellules germinales est que les agents positifs dans ces tests sont présumés être des mutagènes potentiels des cellules germinales humaines.

Situation actuelle et perspectives d'avenir

Des études récentes ont indiqué que seulement trois éléments d'information étaient nécessaires pour détecter environ 90 % d'un ensemble de 41 cancérogènes chez les rongeurs (c.-à-d., cancérogènes humains présumés et mutagènes des cellules somatiques). Celles-ci comprenaient (1) la connaissance de la structure chimique de l'agent, en particulier s'il contient des fractions électrophiles (voir la section sur les relations structure-activité) ; (2) Données sur la mutagénicité de Salmonella ; et (3) les données d'un test de toxicité chronique de 90 jours chez les rongeurs (souris et rats). En effet, pratiquement tous les cancérogènes humains déclarés par le CIRC sont détectables en tant que mutagènes en utilisant uniquement le test Salmonella et le test du micronoyau de moelle osseuse de souris. L'utilisation de ces essais de mutagénicité pour détecter des cancérogènes humains potentiels est étayée par la découverte que la plupart des cancérogènes pour l'homme sont cancérigènes à la fois pour les rats et les souris (cancérigènes trans-espèces) et que la plupart des cancérogènes trans-espèces sont mutagènes pour Salmonella et/ou induisent des micronoyaux. dans la moelle osseuse de souris.

Avec les progrès de la technologie de l'ADN, le projet du génome humain et une meilleure compréhension du rôle de la mutation dans le cancer, de nouveaux tests de génotoxicité sont en cours de développement et seront probablement intégrés aux procédures de dépistage standard. Parmi ceux-ci figurent l'utilisation de cellules transgéniques et de rongeurs. Les systèmes transgéniques sont ceux dans lesquels un gène d'une autre espèce a été introduit dans une cellule ou un organisme. Par exemple, des souris transgéniques sont maintenant utilisées à titre expérimental pour permettre la détection d'une mutation dans n'importe quel organe ou tissu de l'animal, sur la base de l'introduction d'un gène bactérien dans la souris. Des cellules bactériennes, telles que Salmonella, et des cellules de mammifères (y compris des lignées cellulaires humaines) sont désormais disponibles et contiennent des gènes impliqués dans le métabolisme d'agents cancérigènes/mutagènes, tels que les gènes P450. L'analyse moléculaire des mutations réelles induites dans le trans-gène chez les rongeurs transgéniques, ou dans les gènes natifs tels que hprt, ou les gènes cibles au sein de Salmonella peuvent maintenant être analysés, de sorte que la nature exacte des mutations induites par les produits chimiques puisse être déterminée, fournissant des informations sur le mécanisme d'action du produit chimique et permettant des comparaisons avec des mutations chez des humains présumés exposés à l'agent .

Les progrès moléculaires de la cytogénétique permettent maintenant une évaluation plus détaillée des mutations chromosomiques. Celles-ci incluent l'utilisation de sondes (petits morceaux d'ADN) qui se fixent (s'hybrident) à des gènes spécifiques. Des réarrangements de gènes sur le chromosome peuvent alors être révélés par la localisation altérée des sondes, qui sont fluorescentes et facilement visualisables sous forme de secteurs colorés sur les chromosomes. Le test d'électrophorèse sur gel unicellulaire pour la rupture de l'ADN (communément appelé le test «comète») permet la détection des ruptures d'ADN dans des cellules individuelles et peut devenir un outil extrêmement utile en combinaison avec des techniques cytogénétiques pour détecter les dommages chromosomiques.

Après de nombreuses années d'utilisation et la génération d'une base de données importante et systématiquement développée, l'évaluation de la toxicité génétique peut désormais être effectuée avec seulement quelques tests pour un coût relativement faible dans un court laps de temps (quelques semaines). Les données produites peuvent être utilisées pour prédire la capacité d'un agent à être un rongeur et, par présomption, un cancérigène humain/mutagène des cellules somatiques. Une telle capacité permet de limiter l'introduction dans l'environnement d'agents mutagènes et cancérigènes et de développer des agents alternatifs non mutagènes. Les études futures devraient conduire à des méthodes encore meilleures avec une plus grande prédictivité que les tests actuels.

 

Noir

Dimanche, Janvier 16 2011 18: 53

Tests de toxicité in vitro

L'émergence de technologies sophistiquées en biologie moléculaire et cellulaire a stimulé une évolution relativement rapide dans les sciences de la vie, y compris la toxicologie. En effet, le centre d'intérêt de la toxicologie se déplace des animaux entiers et des populations d'animaux entiers vers les cellules et les molécules d'animaux et d'humains individuels. Depuis le milieu des années 1980, les toxicologues ont commencé à utiliser ces nouvelles méthodologies pour évaluer les effets des produits chimiques sur les systèmes vivants. En tant que progression logique, ces méthodes sont adaptées aux fins d'essais de toxicité. Ces avancées scientifiques se sont conjuguées à des facteurs sociaux et économiques pour modifier l'évaluation de la sécurité des produits et des risques potentiels.

Les facteurs économiques sont spécifiquement liés au volume de matériaux qui doivent être testés. Une multitude de nouveaux produits cosmétiques, pharmaceutiques, pesticides, chimiques et ménagers sont introduits sur le marché chaque année. Tous ces produits doivent être évalués pour leur toxicité potentielle. En outre, il existe un arriéré de produits chimiques déjà utilisés qui n'ont pas été suffisamment testés. L'énorme tâche d'obtenir des informations détaillées sur la sécurité de tous ces produits chimiques en utilisant des méthodes traditionnelles d'expérimentation sur des animaux entiers serait coûteuse en termes d'argent et de temps, si elle pouvait même être accomplie.

Il existe également des problèmes de société liés à la santé et à la sécurité publiques, ainsi qu'une préoccupation croissante du public concernant l'utilisation d'animaux pour les tests de sécurité des produits. En ce qui concerne la sécurité humaine, les groupes d'intérêt public et de défense de l'environnement ont exercé une pression importante sur les agences gouvernementales pour qu'elles appliquent des réglementations plus strictes sur les produits chimiques. Un exemple récent de cela a été un mouvement de certains groupes environnementaux pour interdire le chlore et les composés contenant du chlore aux États-Unis. L'une des motivations d'une telle action extrême réside dans le fait que la plupart de ces composés n'ont jamais été suffisamment testés. D'un point de vue toxicologique, le concept d'interdire toute une classe de produits chimiques divers sur la simple base de la présence de chlore est à la fois scientifiquement non fondé et irresponsable. Pourtant, il est compréhensible que du point de vue du public, il doit y avoir une certaine assurance que les produits chimiques rejetés dans l'environnement ne posent pas de risque important pour la santé. Une telle situation souligne la nécessité de méthodes plus efficaces et rapides pour évaluer la toxicité.

L'autre préoccupation sociétale qui a eu un impact sur le domaine des tests de toxicité est le bien-être animal. Le nombre croissant de groupes de protection des animaux à travers le monde ont exprimé une opposition considérable à l'utilisation d'animaux entiers pour les tests de sécurité des produits. Des campagnes actives ont été menées contre les fabricants de cosmétiques, de produits ménagers et de soins personnels et de produits pharmaceutiques pour tenter d'arrêter les tests sur les animaux. Ces efforts en Europe ont abouti à l'adoption du sixième amendement à la directive 76/768/CEE (la directive sur les cosmétiques). La conséquence de cette directive est que les produits cosmétiques ou les ingrédients cosmétiques qui ont été testés sur des animaux après le 1er janvier 1998 ne peuvent être commercialisés dans l'Union européenne, sauf si des méthodes alternatives sont insuffisamment validées. Bien que cette directive n'ait aucune compétence sur la vente de ces produits aux États-Unis ou dans d'autres pays, elle affectera de manière significative les entreprises qui ont des marchés internationaux qui incluent l'Europe.

La notion d'alternatives, qui est à la base du développement de tests autres que ceux sur animaux entiers, est définie par les trois Rs: réduction du nombre d'animaux utilisés; raffinement de protocoles pour que les animaux ressentent moins de stress ou d'inconfort ; et remplacement des tests actuels sur les animaux avec des tests in vitro (c'est-à-dire des tests effectués en dehors de l'animal vivant), des modèles informatiques ou des tests sur des vertébrés inférieurs ou des espèces d'invertébrés. Les trois Rs ont été introduits dans un livre publié en 1959 par deux scientifiques britanniques, WMS Russell et Rex Burch, Les principes de la technique expérimentale humaine. Russell et Burch ont soutenu que la seule façon d'obtenir des résultats scientifiques valables était le traitement humain des animaux et pensaient que des méthodes devraient être développées pour réduire l'utilisation des animaux et finalement la remplacer. Fait intéressant, les principes énoncés par Russell et Burch ont reçu peu d'attention jusqu'à la résurgence du mouvement de protection des animaux au milieu des années 1970. Aujourd'hui, le concept des trois Rs est très à l'avant-garde en matière de recherche, d'essais et d'éducation.

En résumé, le développement de méthodologies d'essais in vitro a été influencé par une variété de facteurs qui ont convergé au cours des dix à vingt dernières années. Il est difficile de déterminer si l'un de ces facteurs à lui seul aurait eu un effet aussi profond sur les stratégies d'essais de toxicité.

Concept des tests de toxicité in vitro

Cette section se concentrera uniquement sur les méthodes in vitro d'évaluation de la toxicité, comme l'une des alternatives aux tests sur l'animal entier. D'autres alternatives non animales telles que la modélisation informatique et les relations quantitatives structure-activité sont abordées dans d'autres articles de ce chapitre.

Les études in vitro sont généralement menées sur des cellules ou des tissus animaux ou humains à l'extérieur du corps. In vitro signifie littéralement « dans du verre », et fait référence à des procédures effectuées sur du matériel vivant ou des composants de matériel vivant cultivés dans des boîtes de Pétri ou dans des tubes à essai dans des conditions définies. Celles-ci peuvent être opposées aux études in vivo, ou celles réalisées « chez l'animal vivant ». Bien qu'il soit difficile, voire impossible, de projeter les effets d'un produit chimique sur un organisme complexe lorsque les observations se limitent à un seul type de cellules dans une boîte, les études in vitro fournissent également une quantité importante d'informations sur la toxicité intrinsèque. que les mécanismes cellulaires et moléculaires de la toxicité. De plus, elles offrent de nombreux avantages par rapport aux études in vivo en ce sens qu'elles sont généralement moins coûteuses et qu'elles peuvent être réalisées dans des conditions plus contrôlées. De plus, malgré le fait qu'un petit nombre d'animaux sont encore nécessaires pour obtenir des cellules pour les cultures in vitro, ces méthodes peuvent être considérées comme des alternatives de réduction (puisque beaucoup moins d'animaux sont utilisés par rapport aux études in vivo) et des alternatives de raffinement (car elles éliminent le besoin soumettre les animaux aux conséquences toxiques néfastes imposées par les expériences in vivo).

Afin d'interpréter les résultats des tests de toxicité in vitro, de déterminer leur utilité potentielle dans l'évaluation de la toxicité et de les relier au processus toxicologique global in vivo, il est nécessaire de comprendre quelle partie du processus toxicologique est examinée. L'ensemble du processus toxicologique consiste en des événements qui commencent par l'exposition de l'organisme à un agent physique ou chimique, progressent par des interactions cellulaires et moléculaires et se manifestent finalement dans la réponse de l'organisme entier. Les tests in vitro sont généralement limités à la partie du processus toxicologique qui se déroule au niveau cellulaire et moléculaire. Les types d'informations pouvant être obtenues à partir d'études in vitro comprennent les voies métaboliques, l'interaction des métabolites actifs avec des cibles cellulaires et moléculaires et des paramètres toxiques potentiellement mesurables qui peuvent servir de biomarqueurs moléculaires pour l'exposition. Dans une situation idéale, le mécanisme de toxicité de chaque produit chimique résultant de l'exposition à la manifestation de l'organisme serait connu, de sorte que les informations obtenues à partir des tests in vitro pourraient être entièrement interprétées et liées à la réponse de l'organisme entier. Cependant, cela est pratiquement impossible, puisque relativement peu de mécanismes toxicologiques complets ont été élucidés. Ainsi, les toxicologues sont confrontés à une situation dans laquelle les résultats d'un test in vitro ne peuvent pas être utilisés comme une prédiction entièrement précise de la toxicité in vivo car le mécanisme est inconnu. Cependant, fréquemment au cours du processus de développement d'un test in vitro, les composants du ou des mécanismes cellulaires et moléculaires de la toxicité sont élucidés.

L'une des principales questions non résolues entourant le développement et la mise en œuvre des tests in vitro est liée à la considération suivante : doivent-ils être basés sur des mécanismes ou suffit-il qu'ils soient descriptifs ? Il est incontestablement préférable, d'un point de vue scientifique, de n'utiliser que des tests basés sur des mécanismes pour remplacer les tests in vivo. Cependant, en l'absence de connaissances mécanistes complètes, la perspective de développer des tests in vitro pour remplacer complètement les tests sur des animaux entiers dans un avenir proche est presque nulle. Cela n'exclut toutefois pas l'utilisation de types de tests plus descriptifs comme outils de dépistage précoce, ce qui est le cas actuellement. Ces écrans ont entraîné une réduction significative de l'utilisation des animaux. Par conséquent, jusqu'à ce que des informations plus mécanistes soient générées, il peut être nécessaire d'employer, dans une mesure plus limitée, des tests dont les résultats sont simplement bien corrélés avec ceux obtenus in vivo.

Tests in vitro de cytotoxicité

Dans cette section, plusieurs tests in vitro qui ont été développés pour évaluer le potentiel cytotoxique d'un produit chimique seront décrits. Pour la plupart, ces tests sont faciles à réaliser et l'analyse peut être automatisée. Un test in vitro couramment utilisé pour la cytotoxicité est le test au rouge neutre. Ce test est effectué sur des cellules en culture et, pour la plupart des applications, les cellules peuvent être maintenues dans des boîtes de culture contenant 96 petits puits de 6.4 mm de diamètre chacun. Étant donné que chaque puits peut être utilisé pour une seule détermination, cet arrangement peut accueillir plusieurs concentrations du produit chimique d'essai ainsi que des contrôles positifs et négatifs avec un nombre suffisant de répétitions pour chacun. Après traitement des cellules avec diverses concentrations du produit chimique d'essai allant d'au moins deux ordres de grandeur (par exemple, de 0.01 mM à 1 mM), ainsi que des produits chimiques témoins positifs et négatifs, les cellules sont rincées et traitées avec du rouge neutre, un colorant qui ne peut être absorbé et retenu que par les cellules vivantes. Le colorant peut être ajouté lors du retrait du produit chimique d'essai pour déterminer les effets immédiats, ou il peut être ajouté à différents moments après le retrait du produit chimique d'essai pour déterminer les effets cumulatifs ou différés. L'intensité de la couleur dans chaque puits correspond au nombre de cellules vivantes dans ce puits. L'intensité de la couleur est mesurée par un spectrophotomètre qui peut être équipé d'un lecteur de plaques. Le lecteur de plaque est programmé pour fournir des mesures individuelles pour chacun des 96 puits de la boîte de culture. Cette méthodologie automatisée permet à l'investigateur d'effectuer rapidement une expérience concentration-réponse et d'obtenir des données statistiquement utiles.

Un autre test relativement simple de cytotoxicité est le test MTT. Le MTT (bromure de 3[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) est un colorant tétrazolium qui est réduit par les enzymes mitochondriales à une couleur bleue. Seules les cellules possédant des mitochondries viables conserveront la capacité de réaliser cette réaction ; par conséquent, l'intensité de la couleur est directement liée au degré d'intégrité mitochondriale. Il s'agit d'un test utile pour détecter les composés cytotoxiques généraux ainsi que les agents qui ciblent spécifiquement les mitochondries.

La mesure de l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH) est également utilisée comme test à grande échelle pour la cytotoxicité. Cette enzyme est normalement présente dans le cytoplasme des cellules vivantes et est libérée dans le milieu de culture cellulaire par les membranes cellulaires non étanches des cellules mortes ou mourantes qui ont été affectées par un agent toxique. De petites quantités de milieu de culture peuvent être retirées à divers moments après le traitement chimique des cellules pour mesurer la quantité de LDH libérée et déterminer une évolution temporelle de la toxicité. Bien que le test de libération de LDH soit une évaluation très générale de la cytotoxicité, il est utile car il est facile à réaliser et peut être effectué en temps réel.

De nombreuses nouvelles méthodes sont en cours de développement pour détecter les dommages cellulaires. Des méthodes plus sophistiquées utilisent des sondes fluorescentes pour mesurer une variété de paramètres intracellulaires, tels que la libération de calcium et les changements de pH et de potentiel de membrane. En général, ces sondes sont très sensibles et peuvent détecter des changements cellulaires plus subtils, réduisant ainsi la nécessité d'utiliser la mort cellulaire comme point final. De plus, bon nombre de ces tests fluorescents peuvent être automatisés par l'utilisation de plaques à 96 puits et de lecteurs de plaques fluorescentes.

Une fois que des données ont été recueillies sur une série de produits chimiques à l'aide de l'un de ces tests, les toxicités relatives peuvent être déterminées. La toxicité relative d'un produit chimique, telle que déterminée dans un essai in vitro, peut être exprimée comme la concentration qui exerce un effet de 50 % sur la réponse finale des cellules non traitées. Cette détermination est appelée CE50 (Effectif Conconcentration pour 50% des cellules) et peut être utilisé pour comparer les toxicités de différents produits chimiques in vitro. (Un terme similaire utilisé pour évaluer la toxicité relative est IC50, indiquant la concentration d'un produit chimique qui provoque une inhibition de 50% d'un processus cellulaire, par exemple, la capacité d'absorber le rouge neutre.) Il n'est pas facile d'évaluer si la toxicité relative in vitro des produits chimiques est comparable à leur relative dans toxicités in vivo, car il existe de nombreux facteurs de confusion dans le système in vivo, tels que la toxicocinétique, le métabolisme, les mécanismes de réparation et de défense. De plus, étant donné que la plupart de ces tests mesurent les paramètres généraux de cytotoxicité, ils ne sont pas basés sur des mécanismes. Par conséquent, l'accord entre les toxicités relatives in vitro et in vivo est simplement corrélatif. Malgré les nombreuses complexités et difficultés d'extrapolation d'in vitro à in vivo, ces tests in vitro s'avèrent très précieux car ils sont simples et peu coûteux à réaliser et peuvent être utilisés comme écrans pour signaler des médicaments ou des produits chimiques hautement toxiques aux premiers stades de la développement.

Toxicité pour les organes cibles

Des tests in vitro peuvent également être utilisés pour évaluer la toxicité spécifique d'un organe cible. Il existe un certain nombre de difficultés associées à la conception de tels tests, la plus notable étant l'incapacité des systèmes in vitro à conserver de nombreuses caractéristiques de l'organe in vivo. Fréquemment, lorsque des cellules sont prélevées sur des animaux et placées en culture, elles ont tendance soit à dégénérer rapidement et/ou à se dédifférencier, c'est-à-dire à perdre leurs fonctions d'organe et à devenir plus génériques. Cela pose un problème en ce que dans un court laps de temps, généralement quelques jours, les cultures ne sont plus utiles pour évaluer les effets spécifiques d'un organe d'une toxine.

Beaucoup de ces problèmes sont en train d'être surmontés grâce aux progrès récents de la biologie moléculaire et cellulaire. Les informations obtenues sur l'environnement cellulaire in vivo peuvent être utilisées pour moduler les conditions de culture in vitro. Depuis le milieu des années 1980, de nouveaux facteurs de croissance et cytokines ont été découverts, et nombre d'entre eux sont maintenant disponibles dans le commerce. L'ajout de ces facteurs aux cellules en culture aide à préserver leur intégrité et peut également aider à conserver des fonctions plus différenciées pendant de plus longues périodes. D'autres études fondamentales ont permis d'approfondir la connaissance des besoins nutritionnels et hormonaux des cellules en culture, permettant de formuler de nouveaux milieux. Des progrès récents ont également été réalisés dans l'identification de matrices extracellulaires naturelles et artificielles sur lesquelles des cellules peuvent être cultivées. La culture de cellules sur ces différentes matrices peut avoir des effets profonds à la fois sur leur structure et leur fonction. Un avantage majeur dérivé de cette connaissance est la capacité de contrôler de manière complexe l'environnement des cellules en culture et d'examiner individuellement les effets de ces facteurs sur les processus cellulaires de base et sur leurs réponses à différents agents chimiques. En bref, ces systèmes peuvent fournir un excellent aperçu des mécanismes de toxicité spécifiques aux organes.

De nombreuses études de toxicité pour les organes cibles sont menées dans des cellules primaires, qui par définition sont fraîchement isolées d'un organe et présentent généralement une durée de vie finie en culture. Il y a de nombreux avantages à avoir des cultures primaires d'un seul type de cellule à partir d'un organe pour l'évaluation de la toxicité. D'un point de vue mécaniste, de telles cultures sont utiles pour étudier des cibles cellulaires spécifiques d'un produit chimique. Dans certains cas, deux ou plusieurs types de cellules d'un organe peuvent être cultivés ensemble, ce qui offre un avantage supplémentaire de pouvoir examiner les interactions cellule-cellule en réponse à une toxine. Certains systèmes de co-culture pour la peau ont été conçus de sorte qu'ils forment une structure tridimensionnelle ressemblant à la peau in vivo. Il est également possible de co-culturer des cellules de différents organes, par exemple le foie et les reins. Ce type de culture serait utile pour évaluer les effets propres aux cellules rénales d'une substance chimique qui doit être bioactivée dans le foie.

Les outils de biologie moléculaire ont également joué un rôle important dans le développement de lignées cellulaires continues qui peuvent être utiles pour les tests de toxicité sur les organes cibles. Ces lignées cellulaires sont générées en transfectant de l'ADN dans des cellules primaires. Dans la procédure de transfection, les cellules et l'ADN sont traités de sorte que l'ADN puisse être absorbé par les cellules. L'ADN provient généralement d'un virus et contient un gène ou des gènes qui, lorsqu'ils sont exprimés, permettent aux cellules de s'immortaliser (c'est-à-dire capables de vivre et de croître pendant de longues périodes de temps en culture). L'ADN peut également être modifié de manière à ce que le gène immortalisant soit contrôlé par un promoteur inductible. L'avantage de ce type de construction est que les cellules ne se diviseront que lorsqu'elles recevront le stimulus chimique approprié pour permettre l'expression du gène immortalisant. Un exemple d'une telle construction est le grand gène de l'antigène T du virus simien 40 (SV40) (le gène immortalisant), précédé de la région promotrice du gène de la métallothionéine, qui est induite par la présence d'un métal dans le milieu de culture. Ainsi, après que le gène est transfecté dans les cellules, les cellules peuvent être traitées avec de faibles concentrations de zinc pour stimuler le promoteur MT et activer l'expression du gène de l'antigène T. Dans ces conditions, les cellules prolifèrent. Lorsque le zinc est éliminé du milieu, les cellules arrêtent de se diviser et, dans des conditions idéales, reviennent à un état où elles expriment leurs fonctions spécifiques aux tissus.

La capacité de générer des cellules immortalisées combinée aux progrès de la technologie de la culture cellulaire a grandement contribué à la création de lignées cellulaires à partir de nombreux organes différents, notamment le cerveau, les reins et le foie. Cependant, avant que ces lignées cellulaires puissent être utilisées comme substitut des types de cellules authentiques, elles doivent être soigneusement caractérisées pour déterminer à quel point elles sont vraiment « normales ».

D'autres systèmes in vitro pour étudier la toxicité d'un organe cible impliquent une complexité croissante. Au fur et à mesure que les systèmes in vitro progressent en complexité, de la cellule unique à la culture d'organes entiers, ils deviennent plus comparables au milieu in vivo, mais en même temps, ils deviennent beaucoup plus difficiles à contrôler compte tenu du nombre accru de variables. Par conséquent, ce qui peut être gagné en passant à un niveau supérieur d'organisation peut être perdu dans l'incapacité du chercheur à contrôler l'environnement expérimental. Le tableau 1 compare certaines des caractéristiques de divers systèmes in vitro qui ont été utilisés pour étudier l'hépatotoxicité.

Tableau 1. Comparaison des systèmes in vitro pour les études d'hépatotoxicité

Système Complexité
(niveau d'interaction)
Capacité à conserver les fonctions spécifiques du foie Durée potentielle de culture Capacité à contrôler l'environnement
Lignées cellulaires immortalisées certains de cellule à cellule (varie selon la lignée cellulaire) médiocre à bon (varie selon la lignée cellulaire) indéfini excellent
Cultures primaires d'hépatocytes cellule à cellule passable à excellent (varie selon les conditions de culture) jours à semaines excellent
Co-cultures de cellules hépatiques cellule à cellule (entre le même type de cellule et des types de cellules différents) bon à excellent semaines excellent
Tranches de foie cellule à cellule (parmi tous les types de cellules) bon à excellent heures en jours Bien
Foie isolé et perfusé cellule à cellule (parmi tous les types de cellules) et intra-organe excellent heures juste

 

Les tranches de tissu coupées avec précision sont utilisées plus largement pour les études toxicologiques. Il existe de nouveaux instruments disponibles qui permettent au chercheur de couper des tranches de tissu uniformes dans un environnement stérile. Les tranches de tissu offrent un certain avantage par rapport aux systèmes de culture cellulaire en ce que tous les types de cellules de l'organe sont présents et qu'ils conservent leur architecture in vivo et leur communication intercellulaire. Ainsi, des études in vitro peuvent être menées pour déterminer le type de cellule cible dans un organe ainsi que pour étudier la toxicité spécifique d'un organe cible. Un inconvénient des tranches est qu'elles dégénèrent rapidement après les premières 24 heures de culture, principalement en raison d'une mauvaise diffusion de l'oxygène vers les cellules à l'intérieur des tranches. Cependant, des études récentes ont indiqué qu'une aération plus efficace peut être obtenue par une rotation douce. Ceci, associé à l'utilisation d'un milieu plus complexe, permet aux tranches de survivre jusqu'à 96 heures.

Les explants de tissus sont similaires dans leur concept aux tranches de tissus et peuvent également être utilisés pour déterminer la toxicité de produits chimiques dans des organes cibles spécifiques. Les explants de tissus sont établis en prélevant un petit morceau de tissu (pour les études de tératogénicité, un embryon intact) et en le plaçant en culture pour une étude plus approfondie. Les cultures d'explants ont été utiles pour les études de toxicité à court terme, y compris l'irritation et la corrosivité de la peau, les études sur l'amiante dans la trachée et les études de neurotoxicité dans les tissus cérébraux.

Des organes perfusés isolés peuvent également être utilisés pour évaluer la toxicité des organes cibles. Ces systèmes offrent un avantage similaire à celui des tranches de tissu et des explants en ce que tous les types de cellules sont présents, mais sans le stress sur le tissu introduit par les manipulations impliquées dans la préparation des tranches. De plus, ils permettent le maintien des interactions intra-organes. Un inconvénient majeur est leur viabilité à court terme, ce qui limite leur utilisation pour les tests de toxicité in vitro. En termes de service d'alternative, ces cultures peuvent être considérées comme un raffinement puisque les animaux ne subissent pas les conséquences néfastes d'un traitement in vivo avec des substances toxiques. Cependant, leur utilisation ne diminue pas de manière significative le nombre d'animaux nécessaires.

En résumé, il existe plusieurs types de systèmes in vitro disponibles pour évaluer la toxicité des organes cibles. Il est possible d'acquérir de nombreuses informations sur les mécanismes de toxicité en utilisant une ou plusieurs de ces techniques. La difficulté reste de savoir extrapoler d'un système in vitro, qui représente une part relativement faible du processus toxicologique, à l'ensemble du processus se déroulant in vivo.

Tests in vitro pour l'irritation oculaire

Le test de toxicité sur l'animal entier le plus controversé du point de vue du bien-être animal est peut-être le test de Draize pour l'irritation des yeux, qui est effectué sur des lapins. Dans ce test, une petite dose fixe d'un produit chimique est placée dans l'un des yeux du lapin tandis que l'autre œil est utilisé comme témoin. Le degré d'irritation et d'inflammation est évalué à différents moments après l'exposition. Un effort important est fait pour développer des méthodologies pour remplacer ce test, qui a été critiqué non seulement pour des raisons humanitaires, mais aussi en raison de la subjectivité des observations et de la variabilité des résultats. Il est intéressant de noter que malgré les sévères critiques que le test de Draize a reçues, il s'est avéré remarquablement efficace pour prédire les irritants oculaires humains, en particulier les substances légèrement à modérément irritantes, qui sont difficiles à identifier par d'autres méthodes. Ainsi, les demandes sur les alternatives in vitro sont grandes.

La recherche d'alternatives au test de Draize est compliquée, même si elle devrait être couronnée de succès. De nombreuses alternatives in vitro et autres ont été développées et, dans certains cas, elles ont été mises en œuvre. Les alternatives de raffinement au test de Draize, qui, par définition, sont moins douloureuses ou stressantes pour les animaux, comprennent le test oculaire à faible volume, dans lequel de plus petites quantités de matériel de test sont placées dans les yeux des lapins, non seulement pour des raisons humanitaires, mais pour imiter plus fidèlement les quantités auxquelles les personnes peuvent être accidentellement exposées. Un autre raffinement est que les substances qui ont un pH inférieur à 2 ou supérieur à 11.5 ne sont plus testées sur les animaux car elles sont connues pour être sévèrement irritantes pour les yeux.

Entre 1980 et 1989, il y a eu une baisse estimée à 87 % du nombre de lapins utilisés pour les tests d'irritation oculaire des cosmétiques. Des tests in vitro ont été incorporés dans le cadre d'une approche de test à plusieurs niveaux pour provoquer cette vaste réduction des tests sur des animaux entiers. Cette approche est un processus en plusieurs étapes qui commence par un examen approfondi des données historiques sur l'irritation oculaire et une analyse physique et chimique du produit chimique à évaluer. Si ces deux processus ne fournissent pas suffisamment d'informations, une batterie de tests in vitro est réalisée. Les données supplémentaires obtenues à partir des tests in vitro pourraient alors être suffisantes pour évaluer la sécurité de la substance. Si ce n'est pas le cas, la dernière étape consisterait à effectuer des tests in vivo limités. Il est facile de voir comment cette approche peut éliminer ou au moins réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires pour prédire l'innocuité d'une substance d'essai.

La batterie de tests in vitro utilisée dans le cadre de cette stratégie de tests à plusieurs niveaux dépend des besoins de l'industrie en question. Les tests d'irritation oculaire sont effectués par une grande variété d'industries, des cosmétiques aux produits pharmaceutiques en passant par les produits chimiques industriels. Le type d'informations requises par chaque industrie varie et il n'est donc pas possible de définir une seule batterie de tests in vitro. Une batterie de tests est généralement conçue pour évaluer cinq paramètres : la cytotoxicité, les modifications de la physiologie et de la biochimie des tissus, les relations quantitatives structure-activité, les médiateurs de l'inflammation, ainsi que la récupération et la réparation. Un exemple de test de cytotoxicité, qui est une cause possible d'irritation, est le test au rouge neutre utilisant des cellules en culture (voir ci-dessus). Les modifications de la physiologie cellulaire et de la biochimie résultant de l'exposition à un produit chimique peuvent être dosées dans des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines. Alternativement, les enquêteurs ont également utilisé des globes oculaires de bovin ou de poulet intacts ou disséqués provenant d'abattoirs. De nombreux paramètres mesurés dans ces cultures d'organes entiers sont les mêmes que ceux mesurés in vivo, tels que l'opacité cornéenne et le gonflement cornéen.

L'inflammation est souvent une composante des lésions oculaires induites par des produits chimiques, et il existe un certain nombre de tests disponibles pour examiner ce paramètre. Divers dosages biochimiques détectent la présence de médiateurs libérés au cours du processus inflammatoire tels que l'acide arachidonique et les cytokines. La membrane chorioallantoïque (CAM) de l'œuf de poule peut également être utilisée comme indicateur d'inflammation. Dans le test CAM, un petit morceau de la coquille d'un embryon de poulet de dix à 14 jours est retiré pour exposer le CAM. Le produit chimique est ensuite appliqué sur la CAM et les signes d'inflammation, tels qu'une hémorragie vasculaire, sont notés à divers moments par la suite.

L'un des processus in vivo les plus difficiles à évaluer in vitro est la récupération et la réparation des lésions oculaires. Un instrument nouvellement développé, le microphysiomètre au silicium, mesure de petits changements dans le pH extracellulaire et peut être utilisé pour surveiller les cellules cultivées en temps réel. Cette analyse s'est avérée assez bien corrélée avec la récupération in vivo et a été utilisée comme test in vitro pour ce processus. Ceci a été un bref aperçu des types de tests utilisés comme alternatives au test de Draize pour l'irritation oculaire. Il est probable qu'au cours des prochaines années, une série complète de batteries de tests in vitro sera définie et chacune sera validée pour son objectif spécifique.

Validation

La clé de l'acceptation réglementaire et de la mise en œuvre des méthodologies de test in vitro est la validation, le processus par lequel la crédibilité d'un test candidat est établie dans un but spécifique. Des efforts pour définir et coordonner le processus de validation ont été faits tant aux États-Unis qu'en Europe. L'Union européenne a créé le Centre européen pour la validation des méthodes alternatives (ECVAM) en 1993 pour y coordonner les efforts et interagir avec des organisations américaines telles que le Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centre universitaire aux États-Unis. , et l'Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), composé de représentants des National Institutes of Health, de l'Environmental Protection Agency des États-Unis, de la Food and Drug Administration des États-Unis et de la Consumer Products Safety Commission.

La validation des tests in vitro nécessite une organisation et une planification importantes. Il doit y avoir un consensus entre les régulateurs gouvernementaux et les scientifiques industriels et universitaires sur les procédures acceptables, et une surveillance suffisante par un conseil consultatif scientifique pour s'assurer que les protocoles respectent les normes établies. Les études de validation doivent être réalisées dans une série de laboratoires de référence à l'aide d'ensembles étalonnés de produits chimiques provenant d'une banque de produits chimiques et de cellules ou de tissus provenant d'une source unique. La répétabilité intralaboratoire et la reproductibilité interlaboratoire d'un test candidat doivent être démontrées et les résultats soumis à une analyse statistique appropriée. Une fois les résultats des différentes composantes des études de validation compilés, le comité consultatif scientifique peut faire des recommandations sur la validité du ou des tests candidats dans un but précis. De plus, les résultats des études devraient être publiés dans des revues à comité de lecture et placés dans une base de données.

La définition du processus de validation est actuellement un travail en cours. Chaque nouvelle étude de validation apportera des informations utiles à la conception de l'étude suivante. La communication et la coopération internationales sont essentielles pour le développement rapide d'une série de protocoles largement acceptables, en particulier compte tenu de l'urgence accrue imposée par l'adoption de la directive CE sur les cosmétiques. Cette législation peut en effet donner l'impulsion nécessaire pour qu'un sérieux effort de validation soit entrepris. Ce n'est qu'après l'achèvement de ce processus que l'acceptation des méthodes in vitro par les diverses communautés réglementaires peut commencer.

Conclusion

Cet article a fourni un large aperçu de l'état actuel des tests de toxicité in vitro. La science de la toxicologie in vitro est relativement jeune, mais elle connaît une croissance exponentielle. Le défi pour les années à venir est d'intégrer les connaissances mécanistes générées par les études cellulaires et moléculaires dans le vaste inventaire des données in vivo pour fournir une description plus complète des mécanismes toxicologiques ainsi que pour établir un paradigme par lequel les données in vitro peuvent être utilisées. prédire la toxicité in vivo. Ce ne sera que grâce aux efforts concertés des toxicologues et des représentants gouvernementaux que la valeur intrinsèque de ces méthodes in vitro pourra être réalisée.

 

Noir

Dimanche, Janvier 16 2011 18: 56

Structurer les relations d'activité

L'analyse des relations structure-activité (SAR) consiste à utiliser des informations sur la structure moléculaire des produits chimiques pour prédire des caractéristiques importantes liées à la persistance, à la distribution, à l'absorption et à l'absorption et à la toxicité. Le SAR est une méthode alternative d'identification des produits chimiques potentiellement dangereux, qui promet d'aider les industries et les gouvernements à hiérarchiser les substances pour une évaluation plus approfondie ou pour la prise de décision à un stade précoce pour de nouveaux produits chimiques. La toxicologie est une entreprise de plus en plus coûteuse et gourmande en ressources. Les préoccupations croissantes concernant le potentiel des produits chimiques à causer des effets néfastes sur les populations humaines exposées ont incité les organismes de réglementation et de santé à élargir la gamme et la sensibilité des tests pour détecter les risques toxicologiques. Dans le même temps, les charges réelles et perçues de la réglementation sur l'industrie ont suscité des inquiétudes quant à l'aspect pratique des méthodes d'essais de toxicité et de l'analyse des données. À l'heure actuelle, la détermination de la cancérogénicité chimique dépend de tests sur la durée de vie d'au moins deux espèces, des deux sexes, à plusieurs doses, avec une analyse histopathologique minutieuse de plusieurs organes, ainsi que la détection de changements prénéoplasiques dans les cellules et les organes cibles. Aux États-Unis, on estime que le test biologique du cancer coûte plus de 3 millions de dollars (dollars de 1995).

Même avec des ressources financières illimitées, la charge de tester les quelque 70,000 1984 produits chimiques existants produits dans le monde aujourd'hui dépasserait les ressources disponibles des toxicologues qualifiés. Des siècles seraient nécessaires pour réaliser ne serait-ce qu'une évaluation de premier niveau de ces produits chimiques (NRC 1993). Dans de nombreux pays, les préoccupations éthiques concernant l'utilisation d'animaux dans les tests de toxicité ont augmenté, ce qui exerce des pressions supplémentaires sur l'utilisation des méthodes standard de test de toxicité. Le SAR a été largement utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour identifier les molécules ayant un potentiel d'utilisation bénéfique dans le traitement (Hansch et Zhang 1979). Dans la politique de santé environnementale et professionnelle, le SAR est utilisé pour prédire la dispersion des composés dans l'environnement physico-chimique et pour sélectionner de nouveaux produits chimiques pour une évaluation plus approfondie de la toxicité potentielle. En vertu de la Toxic Substances Control Act (TSCA) des États-Unis, l'EPA utilise depuis 5 une approche SAR comme « premier crible » des nouveaux produits chimiques dans le processus de notification avant fabrication (PMN) ; L'Australie utilise une approche similaire dans le cadre de sa procédure de notification des nouveaux produits chimiques (NICNAS). Aux États-Unis, l'analyse SAR est une base importante pour déterminer qu'il existe une base raisonnable pour conclure que la fabrication, le traitement, la distribution, l'utilisation ou l'élimination de la substance présentera un risque déraisonnable de préjudice pour la santé humaine ou l'environnement, comme l'exige la section 6(f) de la TSCA. Sur la base de cette découverte, l'EPA peut alors exiger des tests réels de la substance en vertu de la section XNUMX de la TSCA.

Justification du SAR

La justification scientifique du SAR est basée sur l'hypothèse que la structure moléculaire d'un produit chimique prédira des aspects importants de son comportement dans les systèmes physico-chimiques et biologiques (Hansch et Leo 1979).

Processus SAR

Le processus d'examen SAR comprend l'identification de la structure chimique, y compris les formulations empiriques ainsi que le composé pur ; identification de substances structurellement analogues ; rechercher des bases de données et de la littérature pour obtenir des informations sur les analogues structuraux ; et l'analyse de la toxicité et d'autres données sur les analogues structuraux. Dans de rares cas, les informations sur la structure du composé à elles seules peuvent être suffisantes pour étayer certaines analyses SAR, basées sur des mécanismes de toxicité bien compris. Plusieurs bases de données sur le SAR ont été compilées, ainsi que des méthodes informatiques pour la prédiction de la structure moléculaire.

Avec ces informations, les paramètres suivants peuvent être estimés avec SAR :

  • paramètres physico-chimiques : point d'ébullition, pression de vapeur, solubilité dans l'eau, coefficient de partage octanol/eau
  • paramètres du devenir biologique/environnemental : biodégradation, sorption dans le sol, photodégradation, pharmacocinétique
  • paramètres de toxicité : toxicité pour les organismes aquatiques, absorption, toxicité aiguë pour les mammifères (test limite ou LD50), irritation cutanée, pulmonaire et oculaire, sensibilisation, toxicité subchronique, mutagénicité.

 

Il convient de noter qu'il n'existe pas de méthodes SAR pour des paramètres de santé aussi importants que la cancérogénicité, la toxicité pour le développement, la toxicité pour la reproduction, la neurotoxicité, l'immunotoxicité ou d'autres effets sur les organes cibles. Cela est dû à trois facteurs : l'absence d'une grande base de données sur laquelle tester les hypothèses SAR, le manque de connaissances sur les déterminants structurels de l'action toxique et la multiplicité des cellules cibles et des mécanismes impliqués dans ces paramètres (voir "The United States approche d'évaluation des risques des substances toxiques pour la reproduction et des agents neurotoxiques »). Quelques tentatives limitées d'utilisation du SAR pour prédire la pharmacocinétique en utilisant des informations sur les coefficients de partage et la solubilité (Johanson et Naslund 1988). Un SAR quantitatif plus étendu a été réalisé pour prédire le métabolisme dépendant du P450 d'une gamme de composés et la liaison des molécules de type dioxine et PCB au récepteur cytosolique de la « dioxine » (Hansch et Zhang 1993).

Il a été démontré que le DAS a une prévisibilité variable pour certains des paramètres énumérés ci-dessus, comme indiqué dans le tableau 1. Ce tableau présente les données de deux comparaisons de l'activité prévue avec les résultats réels obtenus par des mesures empiriques ou des tests de toxicité. Le SAR, tel qu'il a été mené par des experts de l'US EPA, a obtenu de moins bons résultats pour prédire les propriétés physico-chimiques que pour prédire l'activité biologique, y compris la biodégradation. Pour les paramètres de toxicité, le SAR a obtenu les meilleurs résultats pour prédire la mutagénicité. Ashby et Tennant (1991) dans une étude plus approfondie ont également trouvé une bonne prévisibilité de la génotoxicité à court terme dans leur analyse des produits chimiques NTP. Ces résultats ne sont pas surprenants, compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes moléculaires de la génotoxicité (voir « Toxicologie génétique ») et le rôle de l'électrophilie dans la liaison à l'ADN. En revanche, le SAR avait tendance à sous-estimer la toxicité systémique et subchronique chez les mammifères et à surestimer la toxicité aiguë pour les organismes aquatiques.

Tableau 1. Comparaison des données SAR et des tests : analyses OCDE/NTP

Endpoint Une entente (%) Désaccord (%) Numéro
Point d'ébullition 50 50 30
Pression de vapeur 63 37 113
Solubilité dans l'eau 68 32 133
Coefficient de partage 61 39 82
Biodégradation 93 7 107
Toxicité pour les poissons 77 22 130
Toxicité de la daphnie 67 33 127
Toxicité aiguë pour les mammifères (DL50 ) 80 201 142
Irritation de la peau 82 18 144
Irritation de l'oeil 78 22 144
Sensibilisation cutanée 84 16 144
Toxicité subchronique 57 32 143
Mutagénicité2 88 12 139
Mutagénicité3 82-944 1-10 301
Cancérogénicité3 : Essai biologique de deux ans 72-954 - 301

Source : Données de l'OCDE, communication personnelle C. Auer, US EPA. Seuls les paramètres pour lesquels des prédictions de DAS comparables et des données de test réelles étaient disponibles ont été utilisés dans cette analyse. Les données du NTP proviennent d'Ashby et Tennant 1991.

1 L'incapacité du SAR à prédire la toxicité aiguë de 12 % des produits chimiques testés était préoccupante.

2 Données OCDE, basées sur la concordance du test d'Ames avec le DAS

3 Données du NTP, basées sur des analyses de genetox comparées aux prévisions de DAS pour plusieurs classes de « produits chimiques structurellement alertants ».

4 La concordance varie selon la classe; la concordance la plus élevée était avec les composés amino/nitro aromatiques; le plus bas avec des structures « diverses ».

Pour d'autres paramètres toxiques, comme indiqué ci-dessus, le DAS a une utilité moins démontrable. Les prévisions de toxicité pour les mammifères sont compliquées par le manque de SAR pour la toxicocinétique des molécules complexes. Néanmoins, certaines tentatives ont été faites pour proposer des principes SAR pour des critères complexes de toxicité pour les mammifères (par exemple, voir Bernstein (1984) pour une analyse SAR des substances potentiellement toxiques pour la reproduction mâle). Dans la plupart des cas, la base de données est trop petite pour permettre des tests rigoureux des prédictions basées sur la structure.

À ce stade, on peut conclure que le SAR peut être utile principalement pour hiérarchiser l'investissement dans les ressources d'essais de toxicité ou pour soulever rapidement des préoccupations concernant un danger potentiel. Ce n'est qu'en cas de mutagénicité qu'il est probable que l'analyse SAR en elle-même puisse être utilisée avec fiabilité pour éclairer d'autres décisions. Pour aucun effet, il est probable que le DAS puisse fournir le type d'informations quantitatives requises à des fins d'évaluation des risques, comme indiqué ailleurs dans ce chapitre et Encyclopédie.

 

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Table des matières

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