Il monitoraggio biologico umano utilizza campioni di fluidi corporei o altro materiale biologico facilmente reperibile per la misurazione dell'esposizione a sostanze specifiche o non specifiche e/o ai loro metaboliti o per la misurazione degli effetti biologici di tale esposizione. Il monitoraggio biologico consente di stimare l'esposizione individuale totale attraverso diverse vie di esposizione (polmoni, pelle, tratto gastrointestinale) e diverse fonti di esposizione (aria, dieta, stile di vita o occupazione). È anche noto che in situazioni di esposizione complesse, che molto spesso si incontrano nei luoghi di lavoro, diversi agenti espositivi possono interagire tra loro potenziando o inibendo gli effetti dei singoli composti. E poiché gli individui differiscono nella loro costituzione genetica, mostrano variabilità nella loro risposta alle esposizioni chimiche. Pertanto, può essere più ragionevole cercare i primi effetti direttamente negli individui o nei gruppi esposti piuttosto che tentare di prevedere i potenziali pericoli dei complessi modelli di esposizione dai dati relativi ai singoli composti. Questo è un vantaggio del biomonitoraggio genetico per gli effetti precoci, un approccio che utilizza tecniche che si concentrano sul danno citogenetico, sulle mutazioni puntiformi o sugli addotti del DNA nel tessuto umano surrogato (vedere l'articolo "Principi generali" in questo capitolo).

Cos'è la genotossicità?

La genotossicità degli agenti chimici è un carattere chimico intrinseco, basato sul potenziale elettrofilo dell'agente di legarsi con tali siti nucleofili nelle macromolecole cellulari come l'acido desossiribonucleico, il DNA, il portatore di informazioni ereditarie. La genotossicità è quindi la tossicità manifestata nel materiale genetico delle cellule.

La definizione di genotossicità, come discusso in un rapporto di consenso (IARC 1992), è ampia e include sia effetti diretti che indiretti nel DNA: (1) l'induzione di mutazioni (gene, cromosomiche, genomiche, ricombinanti) che a livello molecolare sono simili a eventi noti per essere coinvolti nella cancerogenesi, (2) eventi surrogati indiretti associati alla mutagenesi (per es. sintesi non programmata del DNA (UDS) e scambio di cromatidi fratelli (SCE), o (3) danno al DNA (per es. ), che possono eventualmente portare a mutazioni.

Genotossicità, mutagenicità e cancerogenicità

Le mutazioni sono cambiamenti ereditari permanenti nelle linee cellulari, orizzontalmente nelle cellule somatiche o verticalmente nelle cellule germinali (sessuali) del corpo. Cioè, le mutazioni possono influenzare l'organismo stesso attraverso cambiamenti nelle cellule del corpo, oppure possono essere trasmesse ad altre generazioni attraverso l'alterazione delle cellule sessuali. La genotossicità precede quindi la mutagenicità sebbene la maggior parte della genotossicità sia riparata e non sia mai espressa come mutazioni. Le mutazioni somatiche sono indotte a livello cellulare e nel caso in cui portino alla morte cellulare oa tumori maligni, possono manifestarsi come vari disturbi dei tessuti o dell'organismo stesso. Si pensa che le mutazioni somatiche siano correlate agli effetti dell'invecchiamento o all'induzione di placche aterosclerotiche (vedi figura 1 e il capitolo Cancro).

Figura 1. Vista schematica del paradigma scientifico in tossicologia genetica ed effetti sulla salute umana

Le mutazioni nella linea cellulare germinale possono essere trasferite allo zigote - la cellula uovo fecondata - ed essere espresse nella generazione della prole (vedi anche il capitolo Sistema riproduttivo). I disturbi mutazionali più importanti riscontrati nel neonato sono indotti dalla malsegregazione dei cromosomi durante la gametogenesi (lo sviluppo delle cellule germinali) e provocano gravi sindromi cromosomiche (p. es., trisomia 21 o sindrome di Down e monosomia X o sindrome di Turner).

Il paradigma della genotossicologia dall'esposizione agli effetti previsti può essere semplificato come mostrato nella figura 1.

La relazione tra genotossicità e cancerogenicità è ben supportata da vari fatti di ricerca indiretti, come mostrato nella figura 2. 

Figura 2. Le interrelazioni di genotossicità e cancerogenicità    

Questa correlazione fornisce la base per l'applicazione di biomarcatori di genotossicità da utilizzare nel monitoraggio umano come indicatori di rischio di cancro.

Tossicità genetica nell'identificazione dei pericoli

Il ruolo dei cambiamenti genetici nella cancerogenesi sottolinea l'importanza dei test di tossicità genetica nell'identificazione di potenziali agenti cancerogeni. Sono stati sviluppati vari metodi di test a breve termine in grado di rilevare alcuni degli endpoint di genotossicità presumibilmente rilevanti nella cancerogenesi.

Sono state condotte diverse indagini approfondite per confrontare la cancerogenicità delle sostanze chimiche con i risultati ottenuti esaminandole in test a breve termine. La conclusione generale è stata che poiché nessun singolo test convalidato può fornire informazioni su tutti gli end-point genetici sopra menzionati; è necessario testare ciascuna sostanza chimica in più di un test. Inoltre, il valore dei test a breve termine di tossicità genetica per la previsione della cancerogenicità chimica è stato discusso e rivisto ripetutamente. Sulla base di tali revisioni, un gruppo di lavoro presso l'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC) ha concluso che la maggior parte degli agenti cancerogeni per l'uomo dà risultati positivi nei test a breve termine utilizzati di routine come il Salmonella saggio e i saggi di aberrazione cromosomica (tabella 1). Tuttavia, bisogna rendersi conto che gli agenti cancerogeni epigenetici - come i composti ormonalmente attivi che possono aumentare l'attività genotossica senza essere essi stessi genotossici - non possono essere rilevati da test a breve termine, che misurano solo l'attività genotossica intrinseca di una sostanza.

Tabella 1. Genotossicità delle sostanze chimiche valutata nei Supplementi 6 e 7 alle Monografie IARC (1986)

Biomonitoraggio genetico

Il monitoraggio genetico utilizza metodi di tossicologia genetica per il monitoraggio biologico degli effetti genetici o la valutazione dell'esposizione genotossica in un gruppo di individui con esposizione definita in un luogo di lavoro o attraverso l'ambiente o lo stile di vita. Pertanto, il monitoraggio genetico ha il potenziale per l'identificazione precoce delle esposizioni genotossiche in un gruppo di persone e consente l'identificazione delle popolazioni ad alto rischio e quindi delle priorità di intervento. L'uso di biomarcatori predittivi in ​​una popolazione esposta è giustificato per risparmiare tempo (rispetto alle tecniche epidemiologiche) e per prevenire effetti finali non necessari, in particolare il cancro (figura 3).

Figura 3. La predittività dei biomarcatori consente di intraprendere azioni preventive per ridurre i rischi per la salute nelle popolazioni umane

I metodi attualmente utilizzati per il biomonitoraggio dell'esposizione genotossica e dei primi effetti biologici sono elencati nella tabella 2. I campioni utilizzati per il biomonitoraggio devono soddisfare diversi criteri, inclusa la necessità che siano facilmente ottenibili e confrontabili con il tessuto bersaglio.

Tabella 2. Biomarcatori nel monitoraggio genetico dell'esposizione alla genotossicità e campioni di cellule/tessuti più comunemente utilizzati.

I tipi di danno al DNA molecolarmente riconoscibile includono la formazione di addotti al DNA e la riorganizzazione della sequenza del DNA. Questi tipi di danno possono essere rilevati mediante misurazioni degli addotti del DNA utilizzando varie tecniche, ad esempio la marcatura 32P o la rilevazione di anticorpi monoclonali contro gli addotti del DNA. La misurazione delle rotture del filamento di DNA viene convenzionalmente eseguita utilizzando analisi di eluizione alcalina o di svolgimento. Le mutazioni possono essere rilevate sequenziando il DNA di un gene specifico, ad esempio il gene HPRT.

Sono apparsi diversi rapporti metodologici che discutono in dettaglio le tecniche della tabella 2 (CEC 1987; IARC 1987, 1992, 1993).

La genotossicità può anche essere monitorata indirettamente attraverso la misurazione degli addotti proteici, cioè nell'emoglobina anziché nel DNA, o il monitoraggio dell'attività di riparazione del DNA. Come strategia di misurazione, l'attività di monitoraggio può essere una tantum o continua. In tutti i casi i risultati devono essere applicati allo sviluppo di condizioni di lavoro sicure.

Biomonitoraggio citogenetico

Una logica teorica ed empirica collega il cancro al danno cromosomico. Gli eventi mutazionali che alterano l'attività o l'espressione dei geni del fattore di crescita sono passaggi chiave nella carcinogenesi. Molti tipi di cancro sono stati associati ad aberrazioni cromosomiche specifiche o non specifiche. In diverse malattie umane ereditarie, l'instabilità cromosomica è associata a una maggiore suscettibilità al cancro.

La sorveglianza citogenetica delle persone esposte a sostanze chimiche cancerogene e/o mutagene oa radiazioni può portare alla luce effetti sul materiale genetico degli individui interessati. Gli studi sull'aberrazione cromosomica delle persone esposte a radiazioni ionizzanti sono stati applicati per la dosimetria biologica per decenni, ma risultati positivi ben documentati sono ancora disponibili solo per un numero limitato di cancerogeni chimici.

Il danno cromosomico microscopicamente riconoscibile comprende sia le aberrazioni cromosomiche strutturali (CA), in cui si è verificato un cambiamento grossolano nella morfologia (forma) di un cromosoma, sia gli scambi di cromatidi fratelli (SCE). SCE è lo scambio simmetrico di materiali cromosomici tra due cromatidi fratelli. I micronuclei (MN) possono derivare da frammenti di cromosomi acentrici o da interi cromosomi in ritardo. Questi tipi di modifiche sono illustrati nella figura 4.

Figura 4. Cromosomi dei linfociti umani in metafase, che rivelano una mutazione cromosomica indotta (freccia che punta a un frammento acentrico)

I linfociti del sangue periferico nell'uomo sono cellule adatte per essere utilizzate negli studi di sorveglianza a causa della loro facile accessibilità e perché possono integrare l'esposizione per una durata di vita relativamente lunga. L'esposizione a una varietà di mutageni chimici può provocare un aumento delle frequenze di CA e/o SCE nei linfociti del sangue di soggetti esposti. Inoltre, l'entità del danno è approssimativamente correlata all'esposizione, sebbene ciò sia stato dimostrato solo con poche sostanze chimiche.

Quando i test citogenetici sui linfociti del sangue periferico mostrano che il materiale genetico è stato danneggiato, i risultati possono essere utilizzati per stimare il rischio solo a livello di popolazione. Una maggiore frequenza di CA in una popolazione dovrebbe essere considerata un'indicazione di un aumento del rischio di cancro, ma i test citogenetici non consentono, in quanto tali, la previsione del rischio individuale di cancro.

Il significato per la salute del danno genetico somatico visto attraverso la finestra ristretta di un campione di linfociti del sangue periferico ha poco o nessun significato per la salute di un individuo, poiché la maggior parte dei linfociti portatori di danno genetico muoiono e vengono sostituiti.

Problemi e loro controllo negli studi di biomonitoraggio umano

Nell'applicazione di qualsiasi metodo di biomonitoraggio umano è necessaria una progettazione rigorosa dello studio, poiché molti fattori interindividuali che non sono correlati alle specifiche esposizioni chimiche di interesse possono influenzare le risposte biologiche studiate. Poiché gli studi di biomonitoraggio umano sono noiosi e difficili sotto molti aspetti, è molto importante un'attenta pianificazione preliminare. Nell'esecuzione di studi citogenetici umani, la conferma sperimentale del potenziale dannoso per i cromosomi dell'agente o degli agenti espositori dovrebbe sempre essere un prerequisito sperimentale.

Negli studi di biomonitoraggio citogenetico sono stati documentati due tipi principali di variazioni. Il primo include fattori tecnici associati alle discrepanze nella lettura dei vetrini e alle condizioni di coltura, in particolare al tipo di terreno, alla temperatura e alla concentrazione di sostanze chimiche (come la bromodeossiuridina o la citocalasina-B). Inoltre, i tempi di campionamento possono alterare i rendimenti delle aberrazioni cromosomiche e forse anche i risultati dell'incidenza di SCE, attraverso i cambiamenti nelle sottopopolazioni di linfociti T e B. Nelle analisi del micronucleo, le differenze metodologiche (ad esempio, l'uso di cellule binucleate indotte dalla citocalasina-B) influenzano abbastanza chiaramente i risultati del punteggio.

Le lesioni indotte nel DNA dei linfociti dall'esposizione chimica che portano alla formazione di aberrazioni cromosomiche strutturali, scambio di cromatidi fratelli e micronuclei devono persistere in vivo fino a quando il sangue non viene prelevato e poi in vitro fino a quando il linfocita in coltura inizia la sintesi del DNA. È quindi importante valutare le cellule subito dopo la prima divisione (nel caso di aberrazioni cromosomiche o micronuclei) o dopo la seconda divisione (scambi di cromatidi fratelli) per ottenere la migliore stima del danno indotto.

Il punteggio costituisce un elemento estremamente importante nel biomonitoraggio citogenetico. I vetrini devono essere randomizzati e codificati per evitare il più possibile errori di valutazione. Dovrebbero essere mantenuti criteri di punteggio coerenti, controllo di qualità e analisi statistiche standardizzate e rapporti. La seconda categoria di variabilità è dovuta a condizioni associate ai soggetti, come età, sesso, farmaci e infezioni. Le variazioni individuali possono anche essere causate dalla suscettibilità genetica agli agenti ambientali.

È fondamentale ottenere un gruppo di controllo simultaneo che corrisponda il più possibile a fattori interni come sesso ed età, nonché a fattori come l'abitudine al fumo, le infezioni virali e le vaccinazioni, l'assunzione di alcol e droghe e l'esposizione ai raggi X. . Inoltre, è necessario ottenere stime qualitative (categoria professionale, anni di esposizione) e quantitative (ad es. campioni di aria della zona di respirazione per analisi chimiche e metaboliti specifici, se possibile) o l'esposizione all'agente o agli agenti genotossici presunti sul posto di lavoro. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata al corretto trattamento statistico dei risultati.

Rilevanza del biomonitoraggio genetico per la valutazione del rischio di cancro

Il numero di agenti ripetutamente dimostrato di indurre cambiamenti citogenetici negli esseri umani è ancora relativamente limitato, ma la maggior parte degli agenti cancerogeni noti inducono danni nei cromosomi dei linfociti.

L'entità del danno è una funzione del livello di esposizione, come è stato dimostrato essere il caso, ad esempio, di cloruro di vinile, benzene, ossido di etilene e agenti antitumorali alchilanti. Anche se gli endpoint citogenetici non sono molto sensibili o specifici per quanto riguarda la rilevazione delle esposizioni che si verificano negli attuali contesti occupazionali, i risultati positivi di tali test hanno spesso richiesto l'attuazione di controlli igienici anche in assenza di prove dirette relative a danni cromosomici somatici a esiti avversi per la salute.

La maggior parte dell'esperienza con l'applicazione del biomonitoraggio citogenetico deriva da situazioni occupazionali di “alta esposizione”. Pochissime esposizioni sono state confermate da diversi studi indipendenti e la maggior parte di queste è stata eseguita utilizzando il biomonitoraggio dell'aberrazione cromosomica. Il database dell'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro elenca nei suoi volumi aggiornati 43-50 delle monografie IARC un totale di 14 cancerogeni occupazionali nei gruppi 1, 2A o 2B, per i quali sono disponibili dati citogenetici umani positivi che nella maggior parte dei casi sono supportato dalla corrispondente citogenetica animale (tabella 3). Questo database limitato suggerisce che esiste una tendenza delle sostanze chimiche cancerogene ad essere clastogeniche e che la clastogenicità tende ad essere associata a cancerogeni umani noti. Chiaramente, tuttavia, non tutti gli agenti cancerogeni inducono danni citogenetici nell'uomo o negli animali da esperimento in vivo. I casi in cui i dati sugli animali sono positivi ei risultati sull'uomo sono negativi possono rappresentare differenze nei livelli di esposizione. Inoltre, le esposizioni umane complesse ea lungo termine sul posto di lavoro potrebbero non essere paragonabili agli esperimenti sugli animali a breve termine.

Tabella 3. Agenti cancerogeni per l'uomo provati, probabili e possibili per i quali esiste un'esposizione professionale e per i quali sono stati misurati endpoint citogenetici sia nell'uomo che negli animali da esperimento

¹ CA, aberrazione cromosomica; SCE, scambio di cromatidi fratelli; MN, micronuclei.
(–) = relazione negativa per uno studio; – = relazione negativa;
(+) = relazione positiva per uno studio; + = relazione positiva;
? = inconcludente; area vuota = non studiato

Fonte: IARC, 1987; aggiornato attraverso i volumi 43-50 delle monografie IARC.

Gli studi sulla genotossicità negli esseri umani esposti includono vari punti finali diversi dai punti terminali cromosomici, come danni al DNA, attività di riparazione del DNA e addotti nel DNA e nelle proteine. Alcuni di questi punti finali possono essere più rilevanti di altri per la previsione del rischio cancerogeno. I cambiamenti genetici stabili (p. es., riarrangiamenti cromosomici, delezioni e mutazioni puntiformi) sono molto rilevanti, poiché è noto che questi tipi di danno sono correlati alla carcinogenesi. Il significato degli addotti del DNA dipende dalla loro identificazione chimica e dalla prova che derivano dall'esposizione. Alcuni endpoint, come SCE, UDS, SSB, rottura del filamento di DNA, sono potenziali indicatori e/o marcatori di eventi genetici; tuttavia, il loro valore è ridotto in assenza di una comprensione meccanicistica della loro capacità di portare a eventi genetici. Chiaramente, il marcatore genetico più rilevante nell'uomo sarebbe l'induzione di una mutazione specifica che è stata direttamente associata al cancro nei roditori esposti all'agente oggetto di studio (figura 5).

Figura 5. Rilevanza dei diversi effetti del biomonitoraggio genetico per il potenziale rischio di cancro

Considerazioni etiche per il biomonitoraggio genetico

I rapidi progressi nelle tecniche genetiche molecolari, la maggiore velocità di sequenziamento del genoma umano e l'identificazione del ruolo dei geni oncosoppressori e dei proto-oncogeni nella carcinogenesi umana sollevano questioni etiche nell'interpretazione, comunicazione e utilizzo di questo tipo di informazione personale. Tecniche in rapido miglioramento per l'analisi dei geni umani consentiranno presto l'identificazione di ancora più geni di suscettibilità ereditaria in individui sani e asintomatici (US Office of Technology Assessment 1990), prestandosi ad essere utilizzati nello screening genetico.

Se l'applicazione dello screening genetico diventerà presto una realtà, sorgeranno molte questioni di interesse sociale ed etico. Già attualmente circa 50 tratti genetici di metabolismo, polimorfismi enzimatici e riparazione del DNA sono sospettati di sensibilità a malattie specifiche ed è disponibile un test diagnostico del DNA per circa 300 malattie genetiche. Dovrebbe essere eseguito uno screening genetico sul posto di lavoro? Chi decide chi sarà sottoposto al test e come verranno utilizzate le informazioni nelle decisioni sull'assunzione? Chi avrà accesso alle informazioni ottenute dallo screening genetico e come verranno comunicati i risultati alle persone coinvolte? Molte di queste domande sono fortemente legate alle norme sociali e ai valori etici prevalenti. L'obiettivo principale deve essere la prevenzione delle malattie e della sofferenza umana, ma occorre rispettare la volontà e le premesse etiche proprie dell'individuo. Alcune delle questioni etiche rilevanti a cui è necessario rispondere molto prima dell'inizio di qualsiasi studio di biomonitoraggio sul posto di lavoro sono riportate nella tabella 4 e sono discusse anche nel capitolo Problemi etici.

Tabella 4. Alcuni principi etici relativi alla necessità di conoscere negli studi di biomonitoraggio genetico occupazionale

Tempo e impegno devono essere dedicati alla fase di pianificazione di qualsiasi studio di biomonitoraggio genetico e tutte le parti necessarie - i dipendenti, i datori di lavoro e il personale medico del posto di lavoro che collabora - devono essere ben informate prima dello studio e i risultati resi noti a anche loro dopo lo studio. Con cure adeguate e risultati affidabili, il biomonitoraggio genetico può contribuire a garantire luoghi di lavoro più sicuri e migliorare la salute dei lavoratori.

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