Lunedi, 20 dicembre 2010 19: 25

Determinanti genetici della risposta tossica

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È stato a lungo riconosciuto che la risposta di ogni persona alle sostanze chimiche ambientali è diversa. La recente esplosione della biologia molecolare e della genetica ha portato a una comprensione più chiara delle basi molecolari di tale variabilità. I principali determinanti della risposta individuale alle sostanze chimiche comprendono importanti differenze tra più di una dozzina di superfamiglie di enzimi, collettivamente denominate xenobiotico- (estraneo al corpo) o metabolizzazione del farmaco enzimi. Sebbene il ruolo di questi enzimi sia stato classicamente considerato quello della disintossicazione, questi stessi enzimi convertono anche un certo numero di composti inerti in intermedi altamente tossici. Recentemente, sono state identificate molte differenze sottili e grossolane nei geni che codificano questi enzimi, che hanno dimostrato di provocare variazioni marcate nell'attività enzimatica. È ormai chiaro che ogni individuo possiede un complemento distinto di attività enzimatiche di metabolizzazione degli xenobiotici; questa diversità potrebbe essere pensata come una "impronta digitale metabolica". È la complessa interazione di queste molte diverse superfamiglie di enzimi che alla fine determina non solo il destino e il potenziale di tossicità di una sostanza chimica in un dato individuo, ma anche la valutazione dell'esposizione. In questo articolo abbiamo scelto di utilizzare la superfamiglia degli enzimi del citocromo P450 per illustrare i notevoli progressi compiuti nella comprensione della risposta individuale alle sostanze chimiche. Lo sviluppo di test basati sul DNA relativamente semplici, progettati per identificare specifiche alterazioni geniche in questi enzimi, sta ora fornendo previsioni più accurate della risposta individuale all'esposizione chimica. Speriamo che il risultato sia una tossicologia preventiva. In altre parole, ogni individuo potrebbe venire a conoscenza di quelle sostanze chimiche alle quali è particolarmente sensibile, evitando così tossicità o tumori precedentemente imprevedibili.

Sebbene non sia generalmente apprezzato, gli esseri umani sono esposti quotidianamente a una raffica di innumerevoli sostanze chimiche diverse. Molte di queste sostanze chimiche sono altamente tossiche e derivano da un'ampia varietà di fonti ambientali e alimentari. La relazione tra tali esposizioni e la salute umana è stata, e continua ad essere, uno dei principali obiettivi degli sforzi della ricerca biomedica in tutto il mondo.

Quali sono alcuni esempi di questo bombardamento chimico? Più di 400 sostanze chimiche del vino rosso sono state isolate e caratterizzate. Si stima che almeno 1,000 sostanze chimiche vengano prodotte da una sigaretta accesa. Ci sono innumerevoli sostanze chimiche nei cosmetici e nei saponi profumati. Un'altra importante fonte di esposizione chimica è l'agricoltura: solo negli Stati Uniti, i terreni agricoli ricevono più di 75,000 sostanze chimiche ogni anno sotto forma di pesticidi, erbicidi e agenti fertilizzanti; dopo l'assorbimento da parte delle piante e degli animali al pascolo, così come dei pesci nei corsi d'acqua vicini, gli esseri umani (alla fine della catena alimentare) ingeriscono queste sostanze chimiche. Altre due fonti di grandi concentrazioni di sostanze chimiche introdotte nel corpo includono (a) droghe assunte cronicamente e (b) esposizione a sostanze pericolose sul posto di lavoro per tutta la vita lavorativa.

È ormai accertato che l'esposizione chimica può influire negativamente su molti aspetti della salute umana, causando malattie croniche e lo sviluppo di molti tipi di cancro. Nell'ultimo decennio circa, le basi molecolari di molte di queste relazioni hanno cominciato a essere svelate. Inoltre, è emersa la consapevolezza che gli esseri umani differiscono notevolmente nella loro suscettibilità agli effetti dannosi dell'esposizione chimica.

Gli attuali sforzi per prevedere la risposta umana all'esposizione chimica combinano due approcci fondamentali (figura 1): monitorare l'entità dell'esposizione umana attraverso marcatori biologici (biomarcatori) e prevedere la probabile risposta di un individuo a un dato livello di esposizione. Sebbene entrambi questi approcci siano estremamente importanti, va sottolineato che i due sono nettamente diversi l'uno dall'altro. Questo articolo si concentrerà sul fattori genetici sottostante suscettibilità individuale a qualsiasi particolare esposizione chimica. Questo campo di ricerca è ampiamente definito ecogenetica, o farmacogenetica (vedi Kalow 1962 e 1992). Molti dei recenti progressi nella determinazione della suscettibilità individuale alla tossicità chimica si sono evoluti da un maggiore apprezzamento dei processi mediante i quali gli esseri umani e altri mammiferi disintossicano le sostanze chimiche e la notevole complessità dei sistemi enzimatici coinvolti.

Figura 1. Le interrelazioni tra la valutazione dell'esposizione, le differenze etniche, l'età, la dieta, la nutrizione e la valutazione della suscettibilità genetica, che giocano tutte un ruolo nel rischio individuale di tossicità e cancroTOX050F1

Per prima cosa descriveremo la variabilità delle risposte tossiche negli esseri umani. Introdurremo quindi alcuni degli enzimi responsabili di tale variazione nella risposta, dovuta a differenze nel metabolismo di sostanze chimiche estranee. Successivamente, verranno dettagliate la storia e la nomenclatura della superfamiglia del citocromo P450. Verranno brevemente descritti cinque polimorfismi P450 umani e diversi polimorfismi non P450; questi sono responsabili delle differenze umane nella risposta tossica. Discuteremo quindi un esempio per sottolineare il fatto che le differenze genetiche negli individui possono influenzare la valutazione dell'esposizione, come determinato dal monitoraggio ambientale. Infine, discuteremo il ruolo di questi enzimi metabolizzanti xenobiotici nelle funzioni vitali critiche.

Variazione nella risposta tossica tra la popolazione umana

Tossicologi e farmacologi parlano comunemente di dose letale media per il 50% della popolazione (LD50), la dose massima media tollerata per il 50% della popolazione (MTD50), e la dose media efficace di un particolare farmaco per il 50% della popolazione (ED50). Tuttavia, in che modo queste dosi influiscono su ciascuno di noi su base individuale? In altre parole, un individuo altamente sensibile può essere 500 volte più colpito o 500 volte più probabilità di essere colpito rispetto all'individuo più resistente in una popolazione; per queste persone il D.L50 (e MTD50 e ED50) i valori avrebbero poco significato. L.D50, MTD50 e ED50 i valori sono rilevanti solo se riferiti alla popolazione nel suo complesso.

Figure 2 illustra un'ipotetica relazione dose-risposta per una risposta tossica da parte di individui in una data popolazione. Questo diagramma generico potrebbe rappresentare il carcinoma broncogeno in risposta al numero di sigarette fumate, la cloracne in funzione dei livelli di diossina sul posto di lavoro, l'asma in funzione delle concentrazioni atmosferiche di ozono o aldeide, le scottature solari in risposta alla luce ultravioletta, la diminuzione del tempo di coagulazione come una funzione di assunzione di aspirina, o disturbi gastrointestinali in risposta al numero di jalapeno peperoni consumati. Generalmente, in ciascuno di questi casi, maggiore è l'esposizione, maggiore è la risposta tossica. La maggior parte della popolazione mostrerà la media e la deviazione standard della risposta tossica in funzione della dose. Il "valore anomalo resistente" (in basso a destra nella figura 2) è un individuo che ha una risposta minore a dosi o esposizioni più elevate. Un "valore anomalo sensibile" (in alto a sinistra) è un individuo che ha una risposta esagerata a una dose o esposizione relativamente piccola. Questi valori anomali, con differenze estreme nella risposta rispetto alla maggior parte degli individui nella popolazione, possono rappresentare importanti varianti genetiche che possono aiutare gli scienziati nel tentativo di comprendere i meccanismi molecolari alla base di una risposta tossica. 

Figura 2. Relazione generica tra qualsiasi risposta tossica e la dose di qualsiasi agente ambientale, chimico o fisico

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Utilizzando questi valori anomali negli studi sulla famiglia, gli scienziati di numerosi laboratori hanno iniziato ad apprezzare l'importanza dell'ereditarietà mendeliana per una data risposta tossica. Successivamente, si può quindi rivolgersi alla biologia molecolare e agli studi genetici per individuare il meccanismo sottostante a livello genico (genotipo) responsabile della malattia causata dall'ambiente (fenotipo).

Enzimi che metabolizzano farmaci e xenobiotici

Come risponde il corpo alla miriade di sostanze chimiche esogene a cui siamo esposti? Gli esseri umani e altri mammiferi hanno sviluppato sistemi enzimatici metabolici altamente complessi che comprendono più di una dozzina di superfamiglie distinte di enzimi. Quasi tutte le sostanze chimiche a cui gli esseri umani sono esposti saranno modificate da questi enzimi, al fine di facilitare la rimozione della sostanza estranea dal corpo. Collettivamente, questi enzimi sono spesso indicati come enzimi che metabolizzano i farmaci or enzimi metabolizzanti xenobiotici. In realtà, entrambi i termini sono termini impropri. In primo luogo, molti di questi enzimi non solo metabolizzano i farmaci, ma centinaia di migliaia di sostanze chimiche ambientali e dietetiche. In secondo luogo, tutti questi enzimi hanno anche normali composti corporei come substrati; nessuno di questi enzimi metabolizza solo sostanze chimiche estranee.

Per più di quattro decenni, i processi metabolici mediati da questi enzimi sono stati comunemente classificati come reazioni di Fase I o di Fase II (figura 3). Le reazioni di fase I ("funzionalizzazione") generalmente comportano modifiche strutturali relativamente minori della sostanza chimica madre tramite ossidazione, riduzione o idrolisi al fine di produrre un metabolita più solubile in acqua. Spesso le reazioni di Fase I forniscono una "maniglia" per ulteriori modifiche di un composto mediante successive reazioni di Fase II. Le reazioni di fase I sono principalmente mediate da una superfamiglia di enzimi altamente versatili, denominati collettivamente citocromi P450, sebbene possano essere coinvolte anche altre superfamiglie di enzimi (figura 4).

Figura 3. La designazione classica degli enzimi di fase I e di fase II che metabolizzano xenobiotici o farmacitox050f4

Figura 4. Esempi di enzimi che metabolizzano i farmaci

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Le reazioni di fase II comportano l'accoppiamento di una molecola endogena idrosolubile a una sostanza chimica (sostanza chimica madre o metabolita di fase I) per facilitare l'escrezione. Le reazioni di fase II sono spesso chiamate reazioni di "coniugazione" o "derivatizzazione". Le superfamiglie di enzimi che catalizzano le reazioni di Fase II sono generalmente denominate in base alla porzione di coniugazione endogena coinvolta: ad esempio, acetilazione da parte delle N-acetiltransferasi, solfatazione da parte delle sulfotransferasi, coniugazione del glutatione da parte delle glutatione transferasi e glucuronidazione da parte delle UDP glucuronosiltransferasi (figura 4) . Sebbene l'organo principale del metabolismo dei farmaci sia il fegato, i livelli di alcuni enzimi che metabolizzano i farmaci sono piuttosto elevati nel tratto gastrointestinale, nelle gonadi, nei polmoni, nel cervello e nei reni, e tali enzimi sono indubbiamente presenti in una certa misura in ogni cellula vivente.

Gli enzimi che metabolizzano gli xenobiotici rappresentano un doppio taglio Swords

Man mano che apprendiamo di più sui processi biologici e chimici che portano alle aberrazioni della salute umana, è diventato sempre più evidente che gli enzimi che metabolizzano i farmaci funzionano in modo ambivalente (figura 3). Nella maggior parte dei casi, le sostanze chimiche liposolubili vengono convertite in metaboliti idrosolubili più facilmente escreti. Tuttavia, è chiaro che in molte occasioni gli stessi enzimi sono in grado di trasformare altri prodotti chimici inerti in molecole altamente reattive. Questi intermedi possono quindi interagire con macromolecole cellulari come proteine ​​e DNA. Pertanto, per ogni sostanza chimica a cui gli esseri umani sono esposti, esiste il potenziale per i percorsi concorrenti di attivazione metabolica ed disintossicazione.

Breve rassegna di genetica

Nella genetica umana, ogni gene (luogo) si trova su una delle 23 coppie di cromosomi. Il due alleli (uno presente su ogni cromosoma della coppia) possono essere uguali, oppure possono essere diversi tra loro. Ad esempio, il B ed b alleli, in cui B (occhi marroni) è dominante b (occhi azzurri): gli individui del fenotipo occhi marroni possono avere sia il BB or Bb genotipi, mentre gli individui del fenotipo occhi azzurri possono avere solo il bb genotipo.

A polimorfismo è definito come due o più fenotipi ereditati stabilmente (tratti) - derivati ​​dallo stesso gene (s) - che sono mantenuti nella popolazione, spesso per ragioni non necessariamente ovvie. Affinché un gene sia polimorfico, il prodotto genico non deve essere essenziale per lo sviluppo, il vigore riproduttivo o altri processi vitali critici. Infatti, un "polimorfismo bilanciato", in cui l'eterozigote ha un netto vantaggio di sopravvivenza rispetto all'uno o all'altro omozigote (ad esempio, la resistenza alla malaria e l'allele dell'emoglobina falciforme) è una spiegazione comune per il mantenimento di un allele nella popolazione a livelli altrimenti inspiegabili frequenze (cfr González e Nebert 1990).

Polimorfismi umani di enzimi metabolizzanti xenobiotici

Le differenze genetiche nel metabolismo di vari farmaci e sostanze chimiche ambientali sono note da più di quattro decenni (Kalow 1962 e 1992). Queste differenze sono spesso indicate come farmacogenetica o, più in generale, polimorfismi ecogenetici. Questi polimorfismi rappresentano alleli varianti che si verificano con una frequenza relativamente alta nella popolazione e sono generalmente associati ad aberrazioni nell'espressione o nella funzione dell'enzima. Storicamente, i polimorfismi venivano solitamente identificati a seguito di risposte inaspettate agli agenti terapeutici. Più di recente, la tecnologia del DNA ricombinante ha consentito agli scienziati di identificare le precise alterazioni nei geni responsabili di alcuni di questi polimorfismi. I polimorfismi sono stati ora caratterizzati in molti enzimi che metabolizzano i farmaci, inclusi gli enzimi sia di fase I che di fase II. Man mano che vengono identificati sempre più polimorfismi, diventa sempre più evidente che ogni individuo può possedere un complemento distinto di enzimi che metabolizzano i farmaci. Questa diversità potrebbe essere descritta come una "impronta digitale metabolica". È la complessa interazione delle varie superfamiglie di enzimi che metabolizzano i farmaci all'interno di ogni individuo che alla fine determinerà la sua particolare risposta a una data sostanza chimica (Kalow 1962 e 1992; Nebert 1988; Gonzalez e Nebert 1990; Nebert e Weber 1990).

Esprimere gli enzimi metabolizzanti xenobiotici umani nella cellula Cultura

Come potremmo sviluppare migliori predittori delle risposte tossiche umane alle sostanze chimiche? I progressi nella definizione della molteplicità degli enzimi che metabolizzano i farmaci devono essere accompagnati da una conoscenza precisa di quali enzimi determinano il destino metabolico delle singole sostanze chimiche. I dati raccolti dagli studi di laboratorio sui roditori hanno sicuramente fornito informazioni utili. Tuttavia, significative differenze interspecie negli enzimi metabolizzanti xenobiotici richiedono cautela nell'estrapolare i dati alle popolazioni umane. Per superare questa difficoltà, molti laboratori hanno sviluppato sistemi in cui varie linee cellulari in coltura possono essere ingegnerizzate per produrre enzimi umani funzionali che sono stabili e in alte concentrazioni (Gonzalez, Crespi e Gelboin 1991). La riuscita produzione di enzimi umani è stata raggiunta in una varietà di diverse linee cellulari da fonti che includono batteri, lieviti, insetti e mammiferi.

Per definire il metabolismo delle sostanze chimiche in modo ancora più accurato, più enzimi sono stati anche prodotti con successo in una singola linea cellulare (Gonzalez, Crespi e Gelboin 1991). Tali linee cellulari forniscono preziose informazioni sui precisi enzimi coinvolti nell'elaborazione metabolica di un dato composto e sui probabili metaboliti tossici. Se queste informazioni possono poi essere combinate con le conoscenze riguardanti la presenza e il livello di un enzima nei tessuti umani, questi dati dovrebbero fornire preziosi predittori di risposta.

Citocromo P450

Storia e nomenclatura

La superfamiglia del citocromo P450 è una delle superfamiglie di enzimi che metabolizzano i farmaci più studiate, con una grande variabilità individuale in risposta alle sostanze chimiche. Il citocromo P450 è un termine generico conveniente usato per descrivere una grande superfamiglia di enzimi fondamentali nel metabolismo di innumerevoli substrati endogeni ed esogeni. Il termine citocromo P450 fu coniato per la prima volta nel 1962 per descrivere uno sconosciuto pigmento nelle cellule che, quando ridotte e legate con monossido di carbonio, producevano un caratteristico picco di assorbimento a 450 nm. Dall'inizio degli anni '1980, la tecnologia di clonazione del cDNA ha portato a notevoli intuizioni sulla molteplicità degli enzimi del citocromo P450. Ad oggi, sono stati identificati più di 400 geni distinti del citocromo P450 in animali, piante, batteri e lieviti. È stato stimato che qualsiasi specie di mammifero, come l'uomo, può possedere 60 o più geni P450 distinti (Nebert e Nelson 1991). La molteplicità dei geni P450 ha reso necessario lo sviluppo di un sistema di nomenclatura standardizzato (Nebert et al. 1987; Nelson et al. 1993). Proposto per la prima volta nel 1987 e aggiornato su base semestrale, il sistema di nomenclatura si basa sull'evoluzione divergente dei confronti delle sequenze di amminoacidi tra le proteine ​​P450. I geni P450 sono divisi in famiglie e sottofamiglie: gli enzimi all'interno di una famiglia mostrano una somiglianza aminoacidica superiore al 40% e quelli all'interno della stessa sottofamiglia mostrano una somiglianza del 55%. I geni P450 sono denominati con il simbolo della radice CYP seguito da un numero arabo che designa la famiglia P450, una lettera che indica la sottofamiglia e un ulteriore numero arabo che designa il singolo gene (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991). Così, CYP1A1 rappresenta il gene P450 1 nella famiglia 1 e nella sottofamiglia A.

Nel febbraio 1995, ce ne sono 403 CYP geni nel database, composto da 59 famiglie e 105 sottofamiglie. Questi includono otto famiglie eucariotiche inferiori, 15 famiglie di piante e 19 famiglie batteriche. Le 15 famiglie di geni umani P450 comprendono 26 sottofamiglie, 22 delle quali sono state mappate in posizioni cromosomiche nella maggior parte del genoma. Alcune sequenze sono chiaramente ortologhe in molte specie, ad esempio solo una CYP17 (steroide 17α-idrossilasi) è stato trovato in tutti i vertebrati esaminati fino ad oggi; altre sequenze all'interno di una sottofamiglia sono altamente duplicate, rendendo impossibile l'identificazione di coppie ortologhe (ad es. CYP2C sottofamiglia). È interessante notare che l'uomo e il lievito condividono un gene ortologo nel CYP51 famiglia. Numerose recensioni complete sono disponibili per i lettori che cercano ulteriori informazioni sulla superfamiglia P450 (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991; Nebert e McKinnon 1994; Guengerich 1993; Gonzalez 1992).

Il successo del sistema di nomenclatura P450 ha portato allo sviluppo di sistemi terminologici simili per le glucuronosiltransferasi UDP (Burchell et al. 1991) e le monoossigenasi contenenti flavina (Lawton et al. 1994). Sistemi di nomenclatura simili basati sull'evoluzione divergente sono in fase di sviluppo anche per diverse altre superfamiglie di enzimi che metabolizzano i farmaci (p. es., sulfotransferasi, epossido idrolasi e aldeide deidrogenasi).

Recentemente, abbiamo diviso la superfamiglia del gene P450 dei mammiferi in tre gruppi (Nebert e McKinnon 1994): quelli coinvolti principalmente nel metabolismo chimico estraneo, quelli coinvolti nella sintesi di vari ormoni steroidei e quelli che partecipano ad altre importanti funzioni endogene. Sono gli enzimi P450 che metabolizzano gli xenobiotici ad assumere il maggior significato per la previsione della tossicità.

Enzimi P450 metabolizzanti xenobiotici

Gli enzimi P450 coinvolti nel metabolismo di composti e farmaci estranei si trovano quasi sempre all'interno delle famiglie CYP1, CYP2, CYP3 ed CYP4. Questi enzimi P450 catalizzano un'ampia varietà di reazioni metaboliche, con un singolo P450 spesso in grado di metabolizzare molti composti diversi. Inoltre, più enzimi P450 possono metabolizzare un singolo composto in siti diversi. Inoltre, un composto può essere metabolizzato nello stesso singolo sito da diversi P450, sebbene a velocità variabili.

Una delle proprietà più importanti degli enzimi P450 che metabolizzano i farmaci è che molti di questi geni sono inducibili dalle stesse sostanze che fungono da loro substrati. D'altra parte, altri geni P450 sono indotti da non substrati. Questo fenomeno di induzione enzimatica è alla base di molte interazioni farmacologiche di importanza terapeutica.

Sebbene presenti in molti tessuti, questi particolari enzimi P450 si trovano a livelli relativamente elevati nel fegato, il sito primario del metabolismo dei farmaci. Alcuni degli enzimi P450 che metabolizzano gli xenobiotici mostrano attività verso certi substrati endogeni (p. es., l'acido arachidonico). Tuttavia, si ritiene generalmente che la maggior parte di questi enzimi P450 che metabolizzano gli xenobiotici non svolga ruoli fisiologici importanti, sebbene ciò non sia stato ancora stabilito sperimentalmente. La rottura omozigote selettiva, o "knock-out", dei singoli geni P450 che metabolizzano gli xenobiotici mediante metodologie di gene targeting nei topi è probabile che fornisca presto informazioni inequivocabili per quanto riguarda i ruoli fisiologici dei P450 che metabolizzano gli xenobiotici (per una rassegna di gene targeting, vedi Capecchi 1994).

Contrariamente alle famiglie P450 che codificano enzimi coinvolti principalmente nei processi fisiologici, le famiglie che codificano enzimi P450 metabolizzanti xenobiotici mostrano una marcata specificità di specie e spesso contengono molti geni attivi per sottofamiglia (Nelson et al. 1993; Nebert et al. 1991). Data l'apparente mancanza di substrati fisiologici, è possibile che gli enzimi P450 siano presenti nelle famiglie CYP1, CYP2, CYP3 ed CYP4 che sono apparsi in passato diverse centinaia di milioni di anni si sono evoluti come mezzo per disintossicare le sostanze chimiche estranee incontrate nell'ambiente e nella dieta. Chiaramente, l'evoluzione dei P450 che metabolizzano gli xenobiotici si sarebbe verificata in un periodo di tempo che precede di gran lunga la sintesi della maggior parte delle sostanze chimiche sintetiche a cui gli esseri umani sono ora esposti. I geni di queste quattro famiglie di geni potrebbero essersi evoluti e divergere negli animali a causa della loro esposizione ai metaboliti delle piante durante gli ultimi 1.2 miliardi di anni, un processo chiamato descrittivamente "guerra animale-pianta" (Gonzalez e Nebert 1990). La guerra animale-pianta è il fenomeno in cui le piante hanno sviluppato nuove sostanze chimiche (fitoalessine) come meccanismo di difesa per prevenire l'ingestione da parte degli animali e gli animali, a loro volta, hanno risposto sviluppando nuovi geni P450 per accogliere i substrati diversificati. A fornire ulteriore slancio a questa proposta sono gli esempi recentemente descritti di guerra chimica pianta-insetto e pianta-fungo che coinvolge la disintossicazione P450 di substrati tossici (Nebert 1994).

Quella che segue è una breve introduzione a molti dei polimorfismi dell'enzima P450 che metabolizzano gli xenobiotici umani in cui si ritiene che i determinanti genetici della risposta tossica siano di grande importanza. Fino a poco tempo fa, i polimorfismi P450 erano generalmente suggeriti da una varianza inaspettata nella risposta del paziente agli agenti terapeutici somministrati. Diversi polimorfismi P450 sono infatti denominati in base al farmaco con cui il polimorfismo è stato identificato per la prima volta. Più recentemente, gli sforzi di ricerca si sono concentrati sull'identificazione degli enzimi P450 precisi coinvolti nel metabolismo delle sostanze chimiche per le quali si osserva la varianza e la caratterizzazione precisa dei geni P450 coinvolti. Come descritto in precedenza, l'attività misurabile di un enzima P450 nei confronti di una sostanza chimica modello può essere chiamata fenotipo. Le differenze alleliche in un gene P450 per ciascun individuo sono chiamate genotipo P450. Poiché sempre più controlli vengono applicati all'analisi dei geni P450, la precisa base molecolare della varianza fenotipica precedentemente documentata sta diventando più chiara.

La sottofamiglia CYP1A

Il CYP1A sottofamiglia comprende due enzimi nell'uomo e in tutti gli altri mammiferi: questi sono designati CYP1A1 e CYP1A2 nella nomenclatura standard P450. Questi enzimi sono di notevole interesse, perché sono coinvolti nell'attivazione metabolica di molti procarcinogeni e sono anche indotti da diversi composti di interesse tossicologico, tra cui la diossina. Ad esempio, il CYP1A1 attiva metabolicamente molti composti presenti nel fumo di sigaretta. Il CYP1A2 attiva metabolicamente molte arilammine, associate al cancro della vescica urinaria, che si trovano nell'industria dei coloranti chimici. Il CYP1A2 attiva anche metabolicamente il 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone (NNK), una nitrosamina derivata dal tabacco. CYP1A1 e CYP1A2 si trovano anche a livelli più elevati nei polmoni dei fumatori di sigarette, a causa dell'induzione da parte degli idrocarburi policiclici presenti nel fumo. I livelli di attività di CYP1A1 e CYP1A2 sono quindi considerati importanti determinanti della risposta individuale a molte sostanze chimiche potenzialmente tossiche.

Interesse tossicologico per il CYP1A sottofamiglia è stata notevolmente intensificata da un rapporto del 1973 che correlava il livello di inducibilità del CYP1A1 nei fumatori di sigarette con la suscettibilità individuale al cancro del polmone (Kellermann, Shaw e Luyten-Kellermann 1973). Le basi molecolari dell'induzione di CYP1A1 e CYP1A2 sono state al centro dell'attenzione di numerosi laboratori. Il processo di induzione è mediato da una proteina chiamata recettore Ah a cui si legano le diossine e le sostanze chimiche strutturalmente correlate. Il nome Ah è derivato dal aryl hnatura idrocarburica di molti induttori del CYP1A. È interessante notare che le differenze nel gene che codifica per il recettore Ah tra ceppi di topi determinano marcate differenze nella risposta chimica e nella tossicità. Un polimorfismo nel gene del recettore Ah sembra verificarsi anche negli esseri umani: circa un decimo della popolazione mostra un'elevata induzione del CYP1A1 e può essere a maggior rischio rispetto agli altri nove decimi della popolazione per lo sviluppo di alcuni tumori indotti chimicamente. Il ruolo del recettore Ah nel controllo degli enzimi nel CYP1A sottofamiglia, e il suo ruolo come determinante della risposta umana all'esposizione chimica, è stata oggetto di diverse revisioni recenti (Nebert, Petersen e Puga 1991; Nebert, Puga e Vasiliou 1993).

Esistono altri polimorfismi che potrebbero controllare il livello delle proteine ​​CYP1A in una cellula? Un polimorfismo in CYP1A1 è stato identificato anche il gene, e questo sembra influenzare il rischio di cancro al polmone tra i fumatori di sigarette giapponesi, sebbene questo stesso polimorfismo non sembri influenzare il rischio in altri gruppi etnici (Nebert e McKinnon 1994).

CYP2C19

Variazioni nella velocità con cui gli individui metabolizzano il farmaco anticonvulsivante (S)-mefenitoina sono state ben documentate da molti anni (Guengerich 1989). Tra il 2% e il 5% dei caucasici e fino al 25% degli asiatici sono carenti di questa attività e possono essere maggiormente a rischio di tossicità dal farmaco. È noto da tempo che questo difetto enzimatico coinvolge un membro dell'essere umano CYP2C sottofamiglia, ma la precisa base molecolare di questa carenza è stata oggetto di notevoli controversie. La ragione principale di questa difficoltà erano i sei o più geni nell'essere umano CYP2C sottofamiglia. È stato recentemente dimostrato, tuttavia, che una mutazione a base singola nel CYP2C19 gene è la causa primaria di questa deficienza (Goldstein e de Morais 1994). È stato anche sviluppato un semplice test del DNA, basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), per identificare rapidamente questa mutazione nelle popolazioni umane (Goldstein e de Morais 1994).

CYP2D6

Forse la variazione più ampiamente caratterizzata in un gene P450 è quella che coinvolge il CYP2D6 gene. Sono stati descritti più di una dozzina di esempi di mutazioni, riarrangiamenti e delezioni che colpiscono questo gene (Meyer 1994). Questo polimorfismo è stato suggerito per la prima volta 20 anni fa dalla variabilità clinica nella risposta dei pazienti all'agente antiipertensivo detritiochina. Alterazioni nel CYP2D6 gene che dà origine all'attività enzimatica alterata sono quindi definiti collettivamente polimorfismo della detriticochina.

Prima dell'avvento degli studi basati sul DNA, gli individui erano stati classificati come metabolizzatori scarsi o estesi (PM, EM) di detritiochina in base alle concentrazioni di metaboliti nei campioni di urina. Ora è chiaro che le alterazioni nel CYP2D6 gene può portare a individui che mostrano non solo un metabolismo scarso o esteso della detritiochina, ma anche un metabolismo ultrarapido. La maggior parte delle alterazioni nel CYP2D6 gene sono associati a carenza parziale o totale della funzione enzimatica; tuttavia, recentemente sono stati descritti individui in due famiglie che possiedono più copie funzionali di CYP2D6 gene, dando origine al metabolismo ultrarapido dei substrati del CYP2D6 (Meyer 1994). Questa notevole osservazione fornisce nuove informazioni sull'ampio spettro di attività del CYP2D6 precedentemente osservato negli studi sulla popolazione. Le alterazioni nella funzione del CYP2D6 sono di particolare importanza, dati gli oltre 30 farmaci comunemente prescritti metabolizzati da questo enzima. La funzione del CYP2D6 di un individuo è quindi un fattore determinante della risposta sia terapeutica che tossica alla terapia somministrata. In effetti, è stato recentemente affermato che la considerazione dello stato del CYP2D6 di un paziente è necessaria per l'uso sicuro di farmaci sia psichiatrici che cardiovascolari.

Il ruolo del CYP2D6 anche il polimorfismo come determinante della suscettibilità individuale a malattie umane come il cancro del polmone e il morbo di Parkinson è stato oggetto di intensi studi (Nebert e McKinnon 1994; Meyer 1994). Sebbene le conclusioni siano difficili da definire data la diversa natura dei protocolli di studio utilizzati, la maggior parte degli studi sembra indicare un'associazione tra estensivi metabolizzatori della detriticochina (fenotipo EM) e cancro del polmone. Le ragioni di tale associazione sono attualmente poco chiare. Tuttavia, è stato dimostrato che l'enzima CYP2D6 metabolizza NNK, una nitrosamina derivata dal tabacco.

Man mano che i test basati sul DNA migliorano, consentendo una valutazione ancora più accurata dello stato del CYP2D6, si prevede che verrà chiarita la relazione precisa del CYP2D6 con il rischio di malattia. Mentre il forte metabolizzatore può essere collegato alla suscettibilità al cancro del polmone, il lento metabolizzatore (fenotipo PM) sembra essere associato al morbo di Parkinson di causa sconosciuta. Anche se questi studi sono difficili da confrontare, sembra che gli individui PM che hanno una ridotta capacità di metabolizzare i substrati del CYP2D6 (ad es.

CYP2E1

Il CYP2E1 gene codifica un enzima che metabolizza molte sostanze chimiche, compresi i farmaci e molti agenti cancerogeni a basso peso molecolare. Questo enzima è interessante anche perché è altamente inducibile dall'alcol e può svolgere un ruolo nel danno epatico indotto da sostanze chimiche come cloroformio, cloruro di vinile e tetracloruro di carbonio. L'enzima si trova principalmente nel fegato e il livello dell'enzima varia notevolmente tra gli individui. Attento esame del CYP2E1 gene ha portato all'identificazione di diversi polimorfismi (Nebert e McKinnon 1994). È stata segnalata una relazione tra la presenza di alcune variazioni strutturali nel CYP2E1 gene e rischio di cancro al polmone apparentemente ridotto in alcuni studi; tuttavia, ci sono chiare differenze interetniche che richiedono chiarimenti su questa possibile relazione.

La sottofamiglia CYP3A

Negli esseri umani, quattro enzimi sono stati identificati come membri del CYP3A sottofamiglia a causa della loro somiglianza nella sequenza degli amminoacidi. Gli enzimi CYP3A metabolizzano molti farmaci comunemente prescritti come l'eritromicina e la ciclosporina. Il contaminante alimentare cancerogeno aflatossina B1 è anche un substrato del CYP3A. Un membro dell'umano CYP3A sottofamiglia, designato CYP3A4, è il principale P450 nel fegato umano oltre ad essere presente nel tratto gastrointestinale. Come è vero per molti altri enzimi P450, il livello di CYP3A4 è molto variabile tra gli individui. Un secondo enzima, denominato CYP3A5, si trova solo nel 25% circa dei fegati; la base genetica di questa scoperta non è stata chiarita. L'importanza della variabilità del CYP3A4 o del CYP3A5 come fattore nei determinanti genetici della risposta tossica non è stata ancora stabilita (Nebert e McKinnon 1994).

Polimorfismi non P450

Numerosi polimorfismi esistono anche all'interno di altre superfamiglie di enzimi metabolizzanti xenobiotici (p. es., glutatione transferasi, UDP glucuronosiltransferasi, para-ossonasi, deidrogenasi, N-acetiltransferasi e mono-ossigenasi contenenti flavina). Poiché la tossicità finale di qualsiasi intermedio generato da P450 dipende dall'efficienza delle successive reazioni di disintossicazione di fase II, il ruolo combinato di più polimorfismi enzimatici è importante nel determinare la suscettibilità alle malattie indotte chimicamente. L'equilibrio metabolico tra le reazioni di Fase I e Fase II (figura 3) è quindi probabilmente un fattore importante nelle malattie umane indotte chimicamente e nei determinanti genetici della risposta tossica.

Il polimorfismo del gene GSTM1

Un esempio ben studiato di un polimorfismo in un enzima di fase II è quello che coinvolge un membro della superfamiglia degli enzimi glutatione S-transferasi, denominato GST mu o GSTM1. Questo particolare enzima è di notevole interesse tossicologico perché sembra essere coinvolto nella successiva disintossicazione dei metaboliti tossici prodotti dalle sostanze chimiche presenti nel fumo di sigaretta da parte dell'enzima CYP1A1. Il polimorfismo identificato in questo gene della glutatione transferasi implica una totale assenza di enzima funzionale in almeno la metà di tutti i caucasici studiati. Questa mancanza di un enzima di fase II sembra essere associata a una maggiore suscettibilità al cancro del polmone. Raggruppando gli individui sulla base di entrambe le varianti CYP1A1 geni e la delezione o la presenza di un funzionale GSM1 gene, è stato dimostrato che il rischio di sviluppare il cancro del polmone indotto dal fumo varia significativamente (Kawajiri, Watanabe e Hayashi 1994). In particolare, gli individui che ne espongono uno raro CYP1A1 alterazione genica, in combinazione con l'assenza del GSM1 gene, erano a più alto rischio (fino a nove volte) di sviluppare il cancro ai polmoni se esposti a un livello relativamente basso di fumo di sigaretta. È interessante notare che sembrano esserci differenze interetniche nel significato dei geni varianti che richiedono ulteriori studi per chiarire il ruolo preciso di tali alterazioni nella suscettibilità alle malattie (Kalow 1962; Nebert e McKinnon 1994; Kawajiri, Watanabe e Hayashi 1994).

Effetto sinergico di due o più polimorfismi sul tossico risposta

Una risposta tossica a un agente ambientale può essere notevolmente esagerata dalla combinazione di due difetti farmacogenetici nello stesso individuo, ad esempio, gli effetti combinati del polimorfismo della N-acetiltransferasi (NAT2) e del polimorfismo della glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) .

L'esposizione occupazionale alle arilammine costituisce un grave rischio di cancro della vescica urinaria. Dopo gli eleganti studi di Cartwright nel 1954, è diventato chiaro che lo stato di N-acetilatore è un determinante del cancro alla vescica indotto da coloranti azoici. Esiste una correlazione altamente significativa tra il fenotipo dell'acetilatore lento e l'insorgenza del cancro della vescica, nonché il grado di invasività di questo cancro nella parete della vescica. Al contrario, esiste un'associazione significativa tra il fenotipo dell'acetilatore rapido e l'incidenza del carcinoma del colon-retto. La N-acetiltransferasi (NAT1, NAT2) sono stati clonati e sequenziati e le analisi basate sul DNA sono ora in grado di rilevare più di una dozzina di varianti alleliche che spiegano il fenotipo dell'acetilatore lento. Il NAT2 il gene è polimorfico e responsabile della maggior parte della variabilità nella risposta tossica alle sostanze chimiche ambientali (Weber 1987; Grant 1993).

La glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) è un enzima critico nella generazione e nel mantenimento del NADPH. Un'attività G6PD bassa o assente può portare a una grave emolisi indotta da farmaci o xenobiotici, a causa dell'assenza di livelli normali di glutatione ridotto (GSH) nei globuli rossi. La carenza di G6PD colpisce almeno 300 milioni di persone in tutto il mondo. Più del 10% dei maschi afroamericani mostra il fenotipo meno grave, mentre alcune comunità sarde mostrano il "tipo mediterraneo" più grave con frequenze che raggiungono una persona su tre. Il G6PD gene è stato clonato e localizzato nel cromosoma X, e numerose diverse mutazioni puntiformi spiegano l'elevato grado di eterogeneità fenotipica osservata negli individui con deficit di G6PD (Beutler 1992).

Il tiozalsulfone, un farmaco arilammina sulfa, è risultato causare una distribuzione bimodale dell'anemia emolitica nella popolazione trattata. Quando vengono trattati con determinati farmaci, gli individui con la combinazione del deficit di G6PD più il fenotipo dell'acetilatore lento sono più colpiti rispetto a quelli con il solo deficit di G6PD o il solo fenotipo dell'acetilatore lento. Gli acetilatori lenti carenti di G6PD sono almeno 40 volte più suscettibili rispetto agli acetilatori rapidi G6PD normali all'emolisi indotta da tiozalsulfone.

Effetto dei polimorfismi genetici sulla valutazione dell'esposizione

La valutazione dell'esposizione e il biomonitoraggio (figura 1) richiedono anche informazioni sulla composizione genetica di ciascun individuo. Data un'esposizione identica a una sostanza chimica pericolosa, il livello di addotti dell'emoglobina (o altri biomarcatori) potrebbe variare di due o tre ordini di grandezza tra gli individui, a seconda dell'impronta metabolica di ciascuna persona.

La stessa farmacogenetica combinata è stata studiata negli operai delle fabbriche chimiche in Germania (tabella 1). Gli addotti dell'emoglobina tra i lavoratori esposti all'anilina e all'acetanilide sono di gran lunga i più alti negli acetilatori lenti carenti di G6PD, rispetto agli altri possibili fenotipi farmacogenetici combinati. Questo studio ha importanti implicazioni per la valutazione dell'esposizione. Questi dati dimostrano che, sebbene due individui possano essere esposti allo stesso livello ambientale di sostanze chimiche pericolose sul posto di lavoro, la quantità di esposizione (tramite biomarcatori come gli addotti dell'emoglobina) potrebbe essere stimata essere inferiore di due o più ordini di grandezza, a causa alla predisposizione genetica sottostante dell'individuo. Allo stesso modo, il rischio risultante di un effetto negativo sulla salute può variare di due o più ordini di grandezza.

Tabella 1: addotti emoglobinici nei lavoratori esposti ad anilina e acetanilide

Stato dell'acetilatore Carenza di G6PD
Connessione Rallentare Non Addotti Hgb
+   +   2
+     + 30
  + +   20
  +   + 100

Fonte: adattato da Lewalter e Korallus 1985.

Differenze genetiche nel legame e nel metabolismo

Va sottolineato che lo stesso caso fatto qui per il metabolismo può essere fatto anche per il legame. Le differenze ereditarie nel legame degli agenti ambientali influenzeranno notevolmente la risposta tossica. Ad esempio, le differenze nel mouse cdm gene può influenzare profondamente la sensibilità individuale alla necrosi testicolare indotta da cadmio (Taylor, Heiniger e Meier 1973). Le differenze nell'affinità di legame del recettore Ah probabilmente influenzano la tossicità e il cancro indotti dalla diossina (Nebert, Petersen e Puga 1991; Nebert, Puga e Vasiliou 1993).

La Figura 5 riassume il ruolo del metabolismo e del legame nella tossicità e nel cancro. Gli agenti tossici, così come esistono nell'ambiente o in seguito al metabolismo o al legame, provocano i loro effetti tramite un percorso genotossico (in cui si verifica un danno al DNA) o un percorso non genotossico (in cui non è necessario che si verifichino danni al DNA e mutagenesi). È interessante notare che recentemente è diventato chiaro che gli agenti "classici" che danneggiano il DNA possono operare attraverso un percorso di trasduzione del segnale non genotossico dipendente dal glutatione ridotto (GSH), che viene avviato sopra o vicino alla superficie cellulare in assenza di DNA e al di fuori del nucleo cellulare (Devary et al. 1993). Le differenze genetiche nel metabolismo e nel legame rimangono, tuttavia, come i principali determinanti nel controllo delle diverse risposte tossiche individuali.

Figura 5. I mezzi generali con cui si verifica la tossicità

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Ruolo della funzione cellulare degli enzimi che metabolizzano i farmaci

La variazione su base genetica nella funzione enzimatica che metabolizza i farmaci è di grande importanza nel determinare la risposta individuale alle sostanze chimiche. Questi enzimi sono fondamentali nel determinare il destino e il decorso temporale di una sostanza chimica estranea dopo l'esposizione.

Come illustrato nella figura 5, l'importanza degli enzimi che metabolizzano i farmaci nella suscettibilità individuale all'esposizione chimica può in effetti presentare un problema molto più complesso di quanto sia evidente da questa semplice discussione del metabolismo xenobiotico. In altre parole, negli ultimi due decenni, i meccanismi genotossici (misurazione degli addotti del DNA e degli addotti proteici) sono stati fortemente enfatizzati. Tuttavia, cosa succede se i meccanismi non genotossici sono importanti almeno quanto i meccanismi genotossici nel causare risposte tossiche?

Come accennato in precedenza, i ruoli fisiologici di molti enzimi che metabolizzano i farmaci coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici non sono stati definiti con precisione. Nebert (1994) ha proposto che, a causa della loro presenza su questo pianeta per più di 3.5 miliardi di anni, gli enzimi che metabolizzano i farmaci fossero originariamente (e sono ancora oggi principalmente) responsabili della regolazione dei livelli cellulari di molti ligandi non peptidici importanti nell'attivazione trascrizionale di geni che influenzano la crescita, il differenziamento, l'apoptosi, l'omeostasi e le funzioni neuroendocrine. Inoltre, la tossicità della maggior parte, se non di tutti, gli agenti ambientali avviene per mezzo di agonista or antagonista azione su queste vie di trasduzione del segnale (Nebert 1994). Sulla base di questa ipotesi, la variabilità genetica negli enzimi che metabolizzano i farmaci può avere effetti piuttosto drammatici su molti processi biochimici critici all'interno della cellula, portando così a differenze importanti nella risposta tossica. È infatti possibile che un tale scenario possa anche essere alla base di molte reazioni avverse idiosincratiche riscontrate in pazienti che usano farmaci comunemente prescritti.

Conclusioni

L'ultimo decennio ha visto notevoli progressi nella nostra comprensione delle basi genetiche della risposta differenziale alle sostanze chimiche nei farmaci, negli alimenti e negli inquinanti ambientali. Gli enzimi che metabolizzano i farmaci hanno una profonda influenza sul modo in cui gli esseri umani rispondono alle sostanze chimiche. Man mano che la nostra consapevolezza della molteplicità degli enzimi che metabolizzano i farmaci continua ad evolversi, siamo sempre più in grado di effettuare valutazioni migliori del rischio tossico per molti farmaci e sostanze chimiche ambientali. Questo è forse più chiaramente illustrato nel caso dell'enzima CYP2D6 citocromo P450. Utilizzando test basati sul DNA relativamente semplici, è possibile prevedere la probabile risposta di qualsiasi farmaco prevalentemente metabolizzato da questo enzima; questa previsione garantirà l'uso più sicuro di farmaci preziosi, ma potenzialmente tossici.

Il futuro vedrà senza dubbio un'esplosione nell'identificazione di ulteriori polimorfismi (fenotipi) che coinvolgono gli enzimi che metabolizzano i farmaci. Queste informazioni saranno accompagnate da test basati sul DNA migliorati e minimamente invasivi per identificare i genotipi nelle popolazioni umane.

Tali studi dovrebbero essere particolarmente istruttivi nella valutazione del ruolo delle sostanze chimiche nelle numerose malattie ambientali di origine attualmente sconosciuta. Anche la considerazione di molteplici polimorfismi enzimatici che metabolizzano farmaci, in combinazione (ad esempio, tabella 1), rappresenta probabilmente un'area di ricerca particolarmente fertile. Tali studi chiariranno il ruolo delle sostanze chimiche nella causa dei tumori. Collettivamente, queste informazioni dovrebbero consentire la formulazione di consigli sempre più personalizzati sull'evitamento di sostanze chimiche che possono essere di interesse individuale. Questo è il campo della tossicologia preventiva. Tali consigli saranno senza dubbio di grande aiuto per tutti gli individui nell'affrontare il carico chimico sempre crescente a cui siamo esposti.

 

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