La neurotossicità e la tossicità riproduttiva sono aree importanti per la valutazione del rischio, poiché i sistemi nervoso e riproduttivo sono altamente sensibili agli effetti xenobiotici. Molti agenti sono stati identificati come tossici per questi sistemi nell'uomo (Barlow e Sullivan 1982; OTA 1990). Molti pesticidi sono deliberatamente progettati per interrompere la riproduzione e la funzione neurologica negli organismi bersaglio, come gli insetti, attraverso l'interferenza con la biochimica ormonale e la neurotrasmissione.

È difficile identificare sostanze potenzialmente tossiche per questi sistemi per tre motivi correlati: in primo luogo, questi sono tra i sistemi biologici più complessi nell'uomo, e i modelli animali della funzione riproduttiva e neurologica sono generalmente riconosciuti come inadeguati per rappresentare eventi critici come la cognizione o sviluppo embriofetale precoce; secondo, non ci sono test semplici per identificare potenziali tossici riproduttivi o neurologici; e terzo, questi sistemi contengono più tipi di cellule e organi, in modo tale che nessun singolo insieme di meccanismi di tossicità può essere utilizzato per dedurre relazioni dose-risposta o prevedere relazioni struttura-attività (SAR). Inoltre, è noto che la sensibilità sia del sistema nervoso che di quello riproduttivo varia con l'età e che le esposizioni in periodi critici possono avere effetti molto più gravi che in altri periodi.

Valutazione del rischio di neurotossicità

La neurotossicità è un importante problema di salute pubblica. Come mostrato nella tabella 1, ci sono stati diversi episodi di neurotossicità umana che hanno coinvolto migliaia di lavoratori e altre popolazioni esposte attraverso rilasci industriali, cibo contaminato, acqua e altri vettori. Le esposizioni professionali a neurotossine come piombo, mercurio, insetticidi organofosfati e solventi clorurati sono diffuse in tutto il mondo (OTA 1990; Johnson 1978).

Tabella 1. Principali incidenti di neurotossicità selezionati

Fonte: OTA 1990.

Le sostanze chimiche possono influenzare il sistema nervoso attraverso azioni su uno qualsiasi dei numerosi bersagli cellulari o processi biochimici all'interno del sistema nervoso centrale o periferico. Gli effetti tossici su altri organi possono colpire anche il sistema nervoso, come nell'esempio dell'encefalopatia epatica. Le manifestazioni di neurotossicità includono effetti sull'apprendimento (inclusi memoria, cognizione e prestazioni intellettuali), processi somatosensoriali (inclusi sensazione e propriorecezione), funzione motoria (inclusi equilibrio, andatura e controllo fine del movimento), affettività (inclusi stato di personalità ed emotività) e sistema nervoso autonomo funzione (controllo nervoso della funzione endocrina e dei sistemi di organi interni). Gli effetti tossici delle sostanze chimiche sul sistema nervoso spesso variano in sensibilità ed espressione con l'età: durante lo sviluppo, il sistema nervoso centrale può essere particolarmente suscettibile all'insulto tossico a causa dell'esteso processo di differenziazione cellulare, migrazione e contatto cellula-cellula. che avviene negli esseri umani (OTA 1990). Inoltre, il danno citotossico al sistema nervoso può essere irreversibile perché i neuroni non vengono sostituiti dopo l'embriogenesi. Mentre il sistema nervoso centrale (SNC) è in qualche modo protetto dal contatto con i composti assorbiti attraverso un sistema di cellule strettamente unite (la barriera emato-encefalica, composta da cellule endoteliali capillari che rivestono il sistema vascolare del cervello), le sostanze chimiche tossiche possono accedere a il SNC mediante tre meccanismi: solventi e composti lipofili possono passare attraverso le membrane cellulari; alcuni composti possono legarsi a proteine ​​trasportatrici endogene che servono a fornire nutrienti e biomolecole al SNC; piccole proteine ​​se inalate possono essere captate direttamente dal nervo olfattivo e trasportate al cervello.

autorità di regolamentazione degli Stati Uniti

L'autorità statutaria per la regolamentazione delle sostanze per la neurotossicità è assegnata a quattro agenzie negli Stati Uniti: la Food and Drug Administration (FDA), l'Environmental Protection Agency (EPA), la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) e la Consumer Product Safety Commission (CPSC). Mentre l'OSHA regola generalmente le esposizioni professionali a sostanze chimiche neurotossiche (e altre), l'EPA ha l'autorità di regolare le esposizioni professionali e non professionali ai pesticidi ai sensi del Federal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act (FIFRA). L'EPA regola anche le nuove sostanze chimiche prima della produzione e della commercializzazione, il che obbliga l'agenzia a considerare sia i rischi professionali che quelli non professionali.

Identificazione dei pericoli

Gli agenti che influenzano negativamente la fisiologia, la biochimica o l'integrità strutturale del sistema nervoso o la funzione del sistema nervoso espressa a livello comportamentale sono definiti come pericoli neurotossici (EPA 1993). La determinazione della neurotossicità intrinseca è un processo difficile, a causa della complessità del sistema nervoso e delle molteplici espressioni della neurotossicità. Alcuni effetti possono apparire ritardati, come la neurotossicità ritardata di alcuni insetticidi organofosfati. Sono richiesti cautela e giudizio nel determinare il rischio neurotossico, inclusa la considerazione delle condizioni di esposizione, dose, durata e tempistica.

L'identificazione del pericolo si basa solitamente su studi tossicologici di organismi intatti, in cui la funzione comportamentale, cognitiva, motoria e somatosensoriale viene valutata con una serie di strumenti investigativi tra cui biochimica, elettrofisiologia e morfologia (Tilson e Cabe 1978; Spencer e Schaumberg 1980). L'importanza di un'attenta osservazione del comportamento dell'intero organismo non può essere sottovalutata. L'identificazione del pericolo richiede anche la valutazione della tossicità nelle diverse fasi dello sviluppo, compresa la prima infanzia (intrauterina e neonatale) e la senescenza. Nell'uomo, l'identificazione della neurotossicità implica la valutazione clinica utilizzando metodi di valutazione neurologica della funzione motoria, fluenza del linguaggio, riflessi, funzione sensoriale, elettrofisiologia, test neuropsicologici e, in alcuni casi, tecniche avanzate di imaging cerebrale ed elettroencefalografia quantitativa. L'OMS ha sviluppato e convalidato una batteria di test di base neurocomportamentale (NCTB), che contiene sonde di funzione motoria, coordinazione occhio-mano, tempo di reazione, memoria immediata, attenzione e umore. Questa batteria è stata convalidata a livello internazionale da un processo coordinato (Johnson 1978).

L'identificazione dei pericoli utilizzando gli animali dipende anche da attenti metodi di osservazione. L'EPA statunitense ha sviluppato una batteria di osservazione funzionale come test di primo livello progettato per rilevare e quantificare i principali effetti neurotossici manifesti (Moser 1990). Questo approccio è anche incorporato nei metodi di prova della tossicità subcronica e cronica dell'OCSE. Una batteria tipica include le seguenti misure: postura; andatura; mobilità; eccitazione generale e reattività; presenza o assenza di tremore, convulsioni, lacrimazione, piloerezione, salivazione, eccesso di minzione o defecazione, stereotipia, movimenti circolari o altri comportamenti bizzarri. I comportamenti suscitati includono la risposta alla manipolazione, il pizzicotto della coda o i clic; equilibrio, riflesso di raddrizzamento e forza di presa degli arti posteriori. Alcuni test rappresentativi e agenti identificati con questi test sono mostrati nella tabella 2.

Tabella 2. Esempi di test specializzati per misurare la neurotossicità

Fonte: EPA 1993.

Questi test possono essere seguiti da valutazioni più complesse solitamente riservate agli studi meccanicistici piuttosto che all'identificazione dei pericoli. I metodi in vitro per l'identificazione del pericolo di neurotossicità sono limitati poiché non forniscono indicazioni sugli effetti su funzioni complesse, come l'apprendimento, ma possono essere molto utili per definire i siti target di tossicità e migliorare la precisione degli studi dose-risposta del sito target (cfr. OMS 1986 e EPA 1993 per discussioni complete su principi e metodi per l'identificazione di potenziali sostanze neurotossiche).

Valutazione dose-risposta

La relazione tra tossicità e dose può essere basata su dati umani quando disponibili o su test su animali, come descritto sopra. Negli Stati Uniti, per i neurotossici viene generalmente utilizzato un approccio basato sul fattore di incertezza o di sicurezza. Questo processo comporta la determinazione di un "livello senza effetti avversi osservati" (NOAEL) o "livello di effetti avversi più basso osservato" (LOAEL) e quindi la divisione di questo numero per fattori di incertezza o sicurezza (di solito multipli di 10) per consentire considerazioni come l'incompletezza di dati, sensibilità potenzialmente più elevata degli esseri umani e variabilità della risposta umana a causa dell'età o di altri fattori dell'ospite. Il numero risultante è definito dose di riferimento (RfD) o concentrazione di riferimento (RfC). L'effetto che si verifica alla dose più bassa nelle specie animali e nel genere più sensibili viene generalmente utilizzato per determinare il LOAEL o il NOAEL. La conversione della dose animale all'esposizione umana viene effettuata mediante metodi standard di dosimetria interspecie, tenendo conto delle differenze nella durata della vita e della durata dell'esposizione.

L'uso dell'approccio del fattore di incertezza presuppone che esista una soglia o una dose al di sotto della quale non viene indotto alcun effetto avverso. Le soglie per neurotossici specifici possono essere difficili da determinare sperimentalmente; si basano su presupposti relativi al meccanismo d'azione che possono valere o meno per tutti i neurotossici (Silbergeld 1990).

Valutazione dell'esposizione

In questa fase, le informazioni vengono valutate su fonti, vie, dosi e durate dell'esposizione al neurotossico per popolazioni umane, sottopopolazioni o anche individui. Queste informazioni possono essere derivate dal monitoraggio dei mezzi ambientali o dal campionamento umano, o da stime basate su scenari standard (come le condizioni del posto di lavoro e le descrizioni del lavoro) o modelli di destino ambientale e dispersione (vedere EPA 1992 per le linee guida generali sui metodi di valutazione dell'esposizione). In alcuni casi limitati, i marcatori biologici possono essere utilizzati per convalidare le deduzioni e le stime dell'esposizione; tuttavia, ci sono relativamente pochi biomarcatori utilizzabili di sostanze neurotossiche.

Caratterizzazione del rischio

La combinazione di identificazione del pericolo, dose-risposta e valutazione dell'esposizione viene utilizzata per sviluppare la caratterizzazione del rischio. Questo processo comporta ipotesi sull'estrapolazione di dosi da alte a basse, estrapolazione dagli animali all'uomo, e l'adeguatezza delle ipotesi di soglia e l'uso di fattori di incertezza.

Tossicologia riproduttiva: metodi di valutazione del rischio

I rischi riproduttivi possono influenzare più endpoint funzionali e bersagli cellulari all'interno degli esseri umani, con conseguenze per la salute dell'individuo interessato e delle generazioni future. I rischi riproduttivi possono influenzare lo sviluppo del sistema riproduttivo nei maschi o nelle femmine, i comportamenti riproduttivi, la funzione ormonale, l'ipotalamo e l'ipofisi, le gonadi e le cellule germinali, la fertilità, la gravidanza e la durata della funzione riproduttiva (OTA 1985). Inoltre, le sostanze chimiche mutagene possono anche influenzare la funzione riproduttiva danneggiando l'integrità delle cellule germinali (Dixon 1985).

La natura e l'entità degli effetti negativi delle esposizioni chimiche sulla funzione riproduttiva nelle popolazioni umane è in gran parte sconosciuta. Sono disponibili relativamente poche informazioni di sorveglianza su endpoint come la fertilità di uomini o donne, l'età della menopausa nelle donne o il numero di spermatozoi negli uomini. Tuttavia, sia uomini che donne sono impiegati in industrie in cui possono verificarsi esposizioni a rischi riproduttivi (OTA 1985).

Questa sezione non ricapitola quegli elementi comuni alla valutazione del rischio di sostanze tossiche neurotossiche e riproduttive, ma si concentra su questioni specifiche per la valutazione del rischio di sostanze tossiche per la riproduzione. Come per le sostanze neurotossiche, l'autorità di regolamentare le sostanze chimiche per la tossicità riproduttiva è conferita per legge all'EPA, all'OSHA, alla FDA e al CPSC. Di queste agenzie, solo l'EPA ha una serie dichiarata di linee guida per la valutazione del rischio di tossicità riproduttiva. Inoltre, lo stato della California ha sviluppato metodi per la valutazione del rischio di tossicità riproduttiva in risposta a una legge statale, la Proposition 65 (Pease et al. 1991).

Le sostanze tossiche per la riproduzione, come le sostanze neurotossiche, possono agire colpendo uno qualsiasi di un certo numero di organi bersaglio o siti molecolari di azione. La loro valutazione è ulteriormente complessa a causa della necessità di valutare separatamente e insieme tre organismi distinti: il maschio, la femmina e la prole (Mattison e Thomford 1989). Mentre un punto finale importante della funzione riproduttiva è la generazione di un bambino sano, anche la biologia riproduttiva svolge un ruolo nella salute degli organismi in via di sviluppo e maturi, indipendentemente dal loro coinvolgimento nella procreazione. Ad esempio, la perdita della funzione ovulatoria dovuta all'esaurimento naturale o alla rimozione chirurgica degli ovociti ha effetti sostanziali sulla salute delle donne, comportando cambiamenti nella pressione sanguigna, nel metabolismo dei lipidi e nella fisiologia ossea. I cambiamenti nella biochimica degli ormoni possono influenzare la suscettibilità al cancro.

Identificazione dei pericoli

L'identificazione di un pericolo riproduttivo può essere effettuata sulla base di dati umani o animali. In generale, i dati sugli esseri umani sono relativamente scarsi, a causa della necessità di un'attenta sorveglianza per rilevare alterazioni nella funzione riproduttiva, come il numero o la qualità dello sperma, la frequenza ovulatoria e la durata del ciclo o l'età alla pubertà. Rilevare i rischi riproduttivi attraverso la raccolta di informazioni sui tassi di fertilità o dati sull'esito della gravidanza può essere confuso dalla soppressione intenzionale della fertilità esercitata da molte coppie attraverso misure di pianificazione familiare. Un attento monitoraggio di popolazioni selezionate indica che i tassi di fallimento riproduttivo (aborto spontaneo) possono essere molto alti, quando vengono valutati i biomarcatori della gravidanza precoce (Sweeney et al. 1988).

I protocolli di test che utilizzano animali da esperimento sono ampiamente utilizzati per identificare le sostanze tossiche per la riproduzione. Nella maggior parte di questi progetti, sviluppati negli Stati Uniti dalla FDA e dall'EPA ea livello internazionale dal programma di linee guida sui test dell'OCSE, gli effetti degli agenti sospetti vengono rilevati in termini di fertilità dopo l'esposizione maschile e/o femminile; osservazione dei comportamenti sessuali legati all'accoppiamento; ed esame istopatologico delle gonadi e delle ghiandole sessuali accessorie, come le ghiandole mammarie (EPA 1994). Spesso gli studi di tossicità riproduttiva comportano la somministrazione continua di animali per una o più generazioni al fine di rilevare gli effetti sul processo riproduttivo integrato nonché di studiare gli effetti su specifici organi della riproduzione. Si raccomandano studi multigenerazionali perché consentono di rilevare gli effetti che possono essere indotti dall'esposizione durante lo sviluppo del sistema riproduttivo in utero. Uno speciale protocollo di test, il Reproductive Assessment by Continuous Breeding (RACB), è stato sviluppato negli Stati Uniti dal National Toxicology Program. Questo test fornisce dati sui cambiamenti nella spaziatura temporale delle gravidanze (che riflettono la funzione ovulatoria), così come il numero e la dimensione delle cucciolate durante l'intero periodo del test. Se esteso alla vita della femmina, può fornire informazioni sui primi fallimenti riproduttivi. Le misurazioni dello sperma possono essere aggiunte al RACB per rilevare i cambiamenti nella funzione riproduttiva maschile. Un test speciale per rilevare la perdita pre o postimpianto è il test letale dominante, progettato per rilevare effetti mutageni nella spermatogenesi maschile.

Sono stati sviluppati anche test in vitro come screening per la tossicità riproduttiva (e dello sviluppo) (Heindel e Chapin 1993). Questi test sono generalmente utilizzati per integrare i risultati dei test in vivo fornendo maggiori informazioni sul sito bersaglio e sul meccanismo degli effetti osservati.

La tabella 3 mostra i tre tipi di endpoint nella valutazione della tossicità riproduttiva: mediata dalla coppia, specifica per la femmina e specifica per il maschio. Gli endpoint mediati dalla coppia includono quelli rilevabili negli studi multigenerazionali e su un singolo organismo. Generalmente includono anche la valutazione della prole. Va notato che la misurazione della fertilità nei roditori è generalmente poco sensibile, rispetto a tale misurazione negli esseri umani, e che gli effetti avversi sulla funzione riproduttiva possono verificarsi a dosi inferiori rispetto a quelle che influenzano significativamente la fertilità (EPA 1994). Gli endpoint specifici per il maschio possono includere test di letalità dominante, nonché valutazione istopatologica di organi e sperma, misurazione degli ormoni e marcatori dello sviluppo sessuale. La funzione degli spermatozoi può anche essere valutata mediante metodi di fecondazione in vitro per rilevare le proprietà di penetrazione e capacitazione delle cellule germinali; questi test sono preziosi perché sono direttamente paragonabili alle valutazioni in vitro condotte nelle cliniche della fertilità umana, ma non forniscono di per sé informazioni dose-risposta. Gli endpoint specifici per le donne includono, oltre all'istopatologia degli organi e alle misurazioni ormonali, la valutazione delle sequele della riproduzione, compresa l'allattamento e la crescita della prole.

Tabella 3. Endpoint in tossicologia riproduttiva

¹ Endpoint che possono essere ottenuti in modo relativamente non invasivo con gli esseri umani.

Fonte: EPA 1994.

Negli Stati Uniti, l'identificazione del pericolo si conclude con una valutazione qualitativa dei dati sulla tossicità in base alla quale si giudica che le sostanze chimiche abbiano prove di pericolo sufficienti o insufficienti (EPA 1994). Le prove "sufficienti" includono dati epidemiologici che forniscono prove convincenti di una relazione causale (o della sua mancanza), sulla base di studi caso-controllo o di coorte o serie di casi ben supportati. Dati sugli animali sufficienti possono essere accoppiati con dati umani limitati per supportare la scoperta di un rischio riproduttivo: per essere sufficienti, gli studi sperimentali sono generalmente tenuti a utilizzare le linee guida sui test di due generazioni dell'EPA e devono includere un minimo di dati che dimostrino un effetto negativo sulla riproduzione in uno studio appropriato e ben condotto su una specie di prova. I dati umani limitati possono o non possono essere disponibili; non è necessario ai fini dell'identificazione del pericolo. Per escludere un potenziale rischio riproduttivo, i dati sugli animali devono includere una serie adeguata di endpoint da più di uno studio che non mostri alcun effetto riproduttivo avverso a dosi minimamente tossiche per l'animale (EPA 1994).

Valutazione dose-risposta

Come per la valutazione delle sostanze neurotossiche, la dimostrazione degli effetti dose-correlati è una parte importante della valutazione del rischio per le sostanze tossiche per la riproduzione. Due particolari difficoltà nelle analisi dose-risposta sorgono a causa della complicata tossicocinetica durante la gravidanza e dell'importanza di distinguere la tossicità riproduttiva specifica dalla tossicità generale per l'organismo. Gli animali debilitati o gli animali con una sostanziale tossicità non specifica (come la perdita di peso) possono non riuscire a ovulare o ad accoppiarsi. La tossicità materna può influenzare la vitalità della gravidanza o il supporto per l'allattamento. Questi effetti, sebbene siano prove di tossicità, non sono specifici della riproduzione (Kimmel et al. 1986). La valutazione della risposta alla dose per un endpoint specifico, come la fertilità, deve essere effettuata nel contesto di una valutazione complessiva della riproduzione e dello sviluppo. Le relazioni dose-risposta per effetti diversi possono differire in modo significativo, ma interferiscono con il rilevamento. Ad esempio, gli agenti che riducono le dimensioni della cucciolata potrebbero non avere alcun effetto sul peso della cucciolata a causa della ridotta competizione per la nutrizione intrauterina.

Valutazione dell'esposizione

Una componente importante della valutazione dell'esposizione per la valutazione del rischio riproduttivo riguarda le informazioni sui tempi e sulla durata delle esposizioni. Le misure di esposizione cumulativa possono non essere sufficientemente precise, a seconda del processo biologico interessato. È noto che le esposizioni a diversi stadi di sviluppo nei maschi e nelle femmine possono portare a esiti diversi sia nell'uomo che negli animali da esperimento (Gray et al. 1988). Anche la natura temporale della spermatogenesi e dell'ovulazione influisce sull'esito. Gli effetti sulla spermatogenesi possono essere reversibili se cessano le esposizioni; tuttavia, la tossicità degli ovociti non è reversibile poiché le femmine hanno un insieme fisso di cellule germinali a cui attingere per l'ovulazione (Mattison e Thomford 1989).

Caratterizzazione del rischio

Come per le sostanze neurotossiche, per le sostanze tossiche per la riproduzione si assume solitamente l'esistenza di una soglia. Tuttavia, le azioni dei composti mutageni sulle cellule germinali possono essere considerate un'eccezione a questa ipotesi generale. Per altri endpoint, un RfD o un RfC viene calcolato come con le sostanze neurotossiche mediante la determinazione del NOAEL o del LOAEL e l'applicazione di appropriati fattori di incertezza. L'effetto utilizzato per determinare il NOAEL o il LOAEL è l'endpoint riproduttivo avverso più sensibile delle specie di mammiferi più appropriate o più sensibili (EPA 1994). I fattori di incertezza includono la considerazione della variazione interspecie e intraspecie, la capacità di definire un vero NOAEL e la sensibilità dell'endpoint rilevato.

Le caratterizzazioni del rischio dovrebbero anche essere focalizzate su specifiche sottopopolazioni a rischio, possibilmente specificando maschi e femmine, stato di gravidanza ed età. Possono essere presi in considerazione anche individui particolarmente sensibili, come donne che allattano, donne con numero di ovociti ridotto o uomini con numero di spermatozoi ridotto e adolescenti in età prepuberale.

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