Metodi di test tossicologici
La parola biomarcatore è l'abbreviazione di marcatore biologico, un termine che si riferisce a un evento misurabile che si verifica in un sistema biologico, come il corpo umano. Questo evento viene quindi interpretato come riflesso, o marcatore, di uno stato più generale dell'organismo o dell'aspettativa di vita. Nella medicina del lavoro, un biomarcatore viene generalmente utilizzato come indicatore dello stato di salute o del rischio di malattia.
I biomarcatori sono utilizzati per studi in vitro e in vivo che possono includere esseri umani. Di solito vengono identificati tre tipi specifici di marcatori biologici. Sebbene alcuni biomarcatori possano essere difficili da classificare, di solito sono separati in biomarcatori di esposizione, biomarcatori di effetto o biomarcatori di suscettibilità (vedi tabella 1).
Tabella 1. Esempi di biomarcatori di esposizione o biomarcatori di effetto utilizzati negli studi tossicologici nella salute sul lavoro
Campione | Misurazione | Scopo |
Biomarcatori di esposizione | ||
Il tessuto adiposo | diossina | Esposizione alla diossina |
Sangue | Piombo | Esposizione al piombo |
Bone | Alluminio | Esposizione di alluminio |
Respiro espirato | toluene | Esposizione al toluene |
Capelli | mercurio | Esposizione al metilmercurio |
Siero | Benzene | Esposizione al benzene |
Urina | Fenolo | Esposizione al benzene |
Effetto biomarcatori | ||
Sangue | Carbossiemoglobina | Esposizione al monossido di carbonio |
globuli rossi | Zinco-protoporfirina | Esposizione al piombo |
Siero | colinesterasi | Esposizione agli organofosfati |
Urina | Microglobuline | Esposizione nefrotossica |
I globuli bianchi | addotti del DNA | Esposizione mutagena |
Dato un grado accettabile di validità, i biomarcatori possono essere impiegati per diversi scopi. Su base individuale, un biomarcatore può essere utilizzato per supportare o confutare una diagnosi di un particolare tipo di avvelenamento o altri effetti avversi indotti chimicamente. In un soggetto sano, un biomarcatore può anche riflettere l'ipersensibilità individuale a specifiche esposizioni chimiche e può quindi servire come base per la previsione del rischio e la consulenza. In gruppi di lavoratori esposti, è possibile applicare alcuni biomarcatori di esposizione per valutare il grado di conformità alle normative sull'abbattimento dell'inquinamento o l'efficacia degli sforzi preventivi in generale.
Biomarcatori di esposizione
Un biomarcatore di esposizione può essere un composto esogeno (o un metabolita) all'interno del corpo, un prodotto interattivo tra il composto (o il metabolita) e un componente endogeno o un altro evento correlato all'esposizione. Più comunemente, i biomarcatori di esposizioni a composti stabili, come i metalli, comprendono misurazioni delle concentrazioni di metalli in campioni appropriati, come sangue, siero o urina. Con le sostanze chimiche volatili, può essere valutata la loro concentrazione nell'aria espirata (dopo l'inalazione di aria priva di contaminazioni). Se il composto viene metabolizzato nel corpo, uno o più metaboliti possono essere scelti come biomarcatore dell'esposizione; i metaboliti sono spesso determinati nei campioni di urina.
I moderni metodi di analisi possono consentire la separazione di isomeri o congeneri di composti organici e la determinazione della speciazione di composti metallici o dei rapporti isotopici di alcuni elementi. Analisi sofisticate consentono di determinare i cambiamenti nella struttura del DNA o di altre macromolecole causati dal legame con sostanze chimiche reattive. Tali tecniche avanzate acquisiranno senza dubbio un'importanza considerevole per le applicazioni negli studi sui biomarcatori, ed è probabile che limiti di rilevamento più bassi e una migliore validità analitica renderanno questi biomarcatori ancora più utili.
Sviluppi particolarmente promettenti si sono verificati con biomarcatori di esposizione a sostanze chimiche mutagene. Questi composti sono reattivi e possono formare addotti con macromolecole, come proteine o DNA. Gli addotti del DNA possono essere rilevati nei globuli bianchi o nelle biopsie tissutali e specifici frammenti di DNA possono essere escreti nelle urine. Ad esempio, l'esposizione all'ossido di etilene provoca reazioni con le basi del DNA e, dopo l'escissione della base danneggiata, l'N-7-(2-idrossietil)guanina verrà eliminata nelle urine. Alcuni addotti potrebbero non riferirsi direttamente a una particolare esposizione. Ad esempio, l'8-idrossi-2'-deossiguanosina riflette il danno ossidativo al DNA e questa reazione può essere innescata da diversi composti chimici, la maggior parte dei quali induce anche la perossidazione lipidica.
Altre macromolecole possono anche essere modificate dalla formazione di addotti o dall'ossidazione. Di particolare interesse, tali composti reattivi possono generare addotti di emoglobina che possono essere determinati come biomarcatori di esposizione ai composti. Il vantaggio è che si possono ottenere ampie quantità di emoglobina da un campione di sangue e, data la durata di quattro mesi dei globuli rossi, gli addotti formati con gli amminoacidi della proteina indicheranno l'esposizione totale durante questo periodo.
Gli addotti possono essere determinati mediante tecniche sensibili come la cromatografia lipidica ad alte prestazioni e sono disponibili anche alcuni metodi immunologici. In generale, i metodi analitici sono nuovi, costosi e necessitano di ulteriore sviluppo e validazione. Una migliore sensibilità può essere ottenuta utilizzando il 32P test di etichettatura post, che è un'indicazione non specifica che si è verificato un danno al DNA. Tutte queste tecniche sono potenzialmente utili per il monitoraggio biologico e sono state applicate in un numero crescente di studi. Tuttavia, sono necessari metodi analitici più semplici e più sensibili. Data la specificità limitata di alcuni metodi a bassi livelli di esposizione, il fumo di tabacco o altri fattori possono avere un impatto significativo sui risultati della misurazione, causando difficoltà di interpretazione.
L'esposizione a composti mutageni, oa composti che vengono metabolizzati in mutageni, può anche essere determinata valutando la mutagenicità dell'urina di un individuo esposto. Il campione di urina viene incubato con un ceppo batterico in cui una specifica mutazione puntiforme è espressa in modo facilmente misurabile. Se nel campione di urina sono presenti sostanze chimiche mutagene, si verificherà un aumento del tasso di mutazioni nei batteri.
I biomarcatori dell'esposizione devono essere valutati in relazione alla variazione temporale dell'esposizione e alla relazione con i diversi compartimenti. Pertanto, l'intervallo di tempo rappresentato dal biomarcatore, ovvero la misura in cui la misurazione del biomarcatore riflette l'esposizione o le esposizioni passate e/o il carico corporeo accumulato, deve essere determinato dai dati tossicocinetici per interpretare il risultato. In particolare, dovrebbe essere considerato il grado in cui il biomarcatore indica la ritenzione in specifici organi bersaglio. Sebbene i campioni di sangue siano spesso utilizzati per gli studi sui biomarcatori, il sangue periferico generalmente non è considerato un compartimento in quanto tale, sebbene funga da mezzo di trasporto tra i compartimenti. Il grado in cui la concentrazione nel sangue riflette i livelli nei diversi organi varia ampiamente tra le diverse sostanze chimiche e di solito dipende anche dalla durata dell'esposizione e dal tempo trascorso dall'esposizione.
A volte questo tipo di evidenza viene utilizzato per classificare un biomarcatore come un indicatore della dose (totale) assorbita o un indicatore della dose efficace (cioè la quantità che ha raggiunto il tessuto bersaglio). Ad esempio, l'esposizione a un particolare solvente può essere valutata dai dati sulla concentrazione effettiva del solvente nel sangue in un particolare momento dopo l'esposizione. Questa misurazione rifletterà la quantità di solvente che è stata assorbita nel corpo. Parte della quantità assorbita verrà espirata a causa della tensione di vapore del solvente. Mentre circola nel sangue, il solvente interagirà con vari componenti del corpo e alla fine sarà soggetto a degradazione da parte degli enzimi. L'esito dei processi metabolici può essere valutato determinando specifici acidi mercapturici prodotti per coniugazione con il glutatione. L'escrezione cumulativa degli acidi mercapturici può riflettere meglio la dose efficace rispetto alla concentrazione ematica.
Gli eventi della vita, come la riproduzione e la senescenza, possono influenzare la distribuzione di una sostanza chimica. La distribuzione delle sostanze chimiche all'interno del corpo è significativamente influenzata dalla gravidanza e molte sostanze chimiche possono attraversare la barriera placentare, causando così l'esposizione del feto. L'allattamento può comportare l'escrezione di sostanze chimiche liposolubili, portando così a una ridotta ritenzione nella madre insieme a un aumento dell'assorbimento da parte del bambino. Durante la perdita di peso o lo sviluppo dell'osteoporosi, possono essere rilasciate sostanze chimiche immagazzinate, che possono quindi provocare una rinnovata e prolungata esposizione "endogena" degli organi bersaglio. Altri fattori possono influenzare l'assorbimento individuale, il metabolismo, la ritenzione e la distribuzione di composti chimici e sono disponibili alcuni biomarcatori di suscettibilità (vedi sotto).
Biomarcatori di effetto
Un indicatore di effetto può essere un componente endogeno, o una misura della capacità funzionale, o qualche altro indicatore dello stato o dell'equilibrio del corpo o del sistema di organi, come influenzato dall'esposizione. Tali marcatori di effetto sono generalmente indicatori preclinici di anomalie.
Questi biomarcatori possono essere specifici o non specifici. I biomarcatori specifici sono utili perché indicano un effetto biologico di una particolare esposizione, fornendo quindi evidenze potenzialmente utilizzabili a scopo preventivo. I biomarcatori non specifici non indicano una singola causa dell'effetto, ma possono riflettere l'effetto totale e integrato dovuto a un'esposizione mista. Entrambi i tipi di biomarcatori possono quindi essere di notevole utilità nella salute sul lavoro.
Non esiste una chiara distinzione tra biomarcatori di esposizione e biomarcatori di effetto. Ad esempio, si potrebbe dire che la formazione di addotti riflette un effetto piuttosto che l'esposizione. Tuttavia, i biomarcatori dell'effetto di solito indicano cambiamenti nelle funzioni delle cellule, dei tessuti o di tutto il corpo. Alcuni ricercatori includono cambiamenti grossolani, come un aumento del peso del fegato degli animali da laboratorio esposti o una diminuzione della crescita nei bambini, come biomarcatori dell'effetto. Ai fini della salute sul lavoro, i biomarcatori degli effetti dovrebbero essere limitati a quelli che indicano cambiamenti biochimici subclinici o reversibili, come l'inibizione degli enzimi. L'effetto biomarcatore più frequentemente utilizzato è probabilmente l'inibizione della colinesterasi causata da alcuni insetticidi, cioè organofosfati e carbammati. Nella maggior parte dei casi, questo effetto è del tutto reversibile e l'inibizione enzimatica riflette l'esposizione totale a questo particolare gruppo di insetticidi.
Alcune esposizioni non provocano l'inibizione enzimatica ma piuttosto un aumento dell'attività di un enzima. Questo è il caso di diversi enzimi che appartengono alla famiglia P450 (vedi “Determinanti genetici della risposta tossica”). Possono essere indotti dall'esposizione a determinati solventi e idrocarburi poliaromatici (IPA). Poiché questi enzimi sono espressi principalmente in tessuti dai quali può essere difficile ottenere una biopsia, l'attività enzimatica viene determinata indirettamente in vivo somministrando un composto che viene metabolizzato da quel particolare enzima, e quindi il prodotto di degradazione viene misurato nelle urine o nel plasma.
Altre esposizioni possono indurre la sintesi di una proteina protettiva nel corpo. L'esempio migliore è probabilmente la metallotioneina, che lega il cadmio e favorisce l'escrezione di questo metallo; l'esposizione al cadmio è uno dei fattori che determinano un aumento dell'espressione del gene della metallotioneina. Potrebbero esistere proteine protettive simili, ma non sono state ancora esplorate a sufficienza per essere accettate come biomarcatori. Tra i candidati per un possibile utilizzo come biomarcatori ci sono le cosiddette proteine dello stress, originariamente chiamate proteine da shock termico. Queste proteine sono generate da una gamma di organismi diversi in risposta a una varietà di esposizioni avverse.
Il danno ossidativo può essere valutato determinando la concentrazione di malondialdeide nel siero o l'esalazione di etano. Allo stesso modo, l'escrezione urinaria di proteine con un piccolo peso molecolare, come l'albumina, può essere utilizzata come biomarcatore di danno renale precoce. Diversi parametri abitualmente utilizzati nella pratica clinica (ad esempio, ormoni sierici o livelli di enzimi) possono anche essere utili come biomarcatori. Tuttavia, molti di questi parametri potrebbero non essere sufficientemente sensibili per rilevare una compromissione precoce.
Un altro gruppo di parametri di effetto riguarda gli effetti genotossici (cambiamenti nella struttura dei cromosomi). Tali effetti possono essere rilevati mediante microscopia dei globuli bianchi che subiscono la divisione cellulare. Al microscopio si possono vedere gravi danni ai cromosomi - aberrazioni cromosomiche o formazione di micronuclei. Il danno può anche essere rivelato aggiungendo un colorante alle cellule durante la divisione cellulare. L'esposizione a un agente genotossico può quindi essere visualizzata come un aumento dello scambio del colorante tra i due cromatidi di ciascun cromosoma (scambio di cromatidi fratelli). Le aberrazioni cromosomiche sono correlate a un aumentato rischio di sviluppare il cancro, ma il significato di un aumento del tasso di scambio di cromatidi fratelli è meno chiaro.
Una valutazione più sofisticata della genotossicità si basa su particolari mutazioni puntiformi nelle cellule somatiche, cioè globuli bianchi o cellule epiteliali ottenute dalla mucosa orale. Una mutazione in un locus specifico può rendere le cellule capaci di crescere in una coltura che contiene una sostanza chimica altrimenti tossica (come la 6-tioguanina). In alternativa, può essere valutato uno specifico prodotto genico (p. es., concentrazioni sieriche o tissutali di oncoproteine codificate da particolari oncogeni). Ovviamente, queste mutazioni riflettono il danno genotossico totale subito e non indicano necessariamente nulla sull'esposizione causale. Questi metodi non sono ancora pronti per l'uso pratico nella medicina del lavoro, ma i rapidi progressi in questa linea di ricerca suggeriscono che tali metodi saranno disponibili entro pochi anni.
Biomarcatori di suscettibilità
Un marcatore di suscettibilità, ereditaria o indotta, è un indicatore che l'individuo è particolarmente sensibile all'effetto di uno xenobiotico o agli effetti di un gruppo di tali composti. La maggior parte dell'attenzione è stata focalizzata sulla suscettibilità genetica, sebbene altri fattori possano essere almeno altrettanto importanti. L'ipersensibilità può essere dovuta a un tratto ereditario, alla costituzione dell'individuo oa fattori ambientali.
La capacità di metabolizzare alcune sostanze chimiche è variabile ed è geneticamente determinata (vedi “Determinanti genetici della risposta tossica”). Diversi enzimi rilevanti sembrano essere controllati da un singolo gene. Ad esempio, l'ossidazione di sostanze chimiche estranee viene effettuata principalmente da una famiglia di enzimi appartenenti alla famiglia P450. Altri enzimi rendono i metaboliti più solubili in acqua per coniugazione (p. es., N-acetiltransferasi e μ-glutatione-S-transferasi). L'attività di questi enzimi è geneticamente controllata e varia considerevolmente. Come accennato in precedenza, l'attività può essere determinata somministrando una piccola dose di un farmaco e quindi determinando la quantità del metabolita nelle urine. Alcuni dei geni sono stati ora caratterizzati e sono disponibili tecniche per determinare il genotipo. Importanti studi suggeriscono che il rischio di sviluppare determinate forme tumorali è correlato alla capacità di metabolizzare composti estranei. Molte domande rimangono ancora senza risposta, limitando così in questo momento l'uso di questi potenziali biomarcatori di suscettibilità nella salute sul lavoro.
Altri tratti ereditari, come l'alfa1-la carenza di antitripsina o la carenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, provocano anch'esse meccanismi di difesa carenti nell'organismo, causando in tal modo ipersuscettibilità a determinate esposizioni.
La maggior parte delle ricerche relative alla suscettibilità si è occupata della predisposizione genetica. Anche altri fattori giocano un ruolo e sono stati in parte trascurati. Ad esempio, gli individui con una malattia cronica possono essere più sensibili a un'esposizione professionale. Inoltre, se un processo patologico o una precedente esposizione a sostanze chimiche tossiche ha causato danni subclinici agli organi, è probabile che la capacità di resistere a una nuova esposizione tossica sia inferiore. Gli indicatori biochimici della funzione dell'organo possono in questo caso essere usati come biomarcatori di suscettibilità. Forse il miglior esempio di ipersuscettibilità riguarda le risposte allergiche. Se un individuo è diventato sensibilizzato a una particolare esposizione, nel siero possono essere rilevati anticorpi specifici. Anche se l'individuo non è diventato sensibilizzato, altre esposizioni attuali o passate possono aumentare il rischio di sviluppare un effetto avverso correlato a un'esposizione professionale.
Uno dei problemi principali è determinare l'effetto congiunto delle esposizioni miste sul lavoro. Inoltre, le abitudini personali e l'uso di droghe possono determinare un aumento della suscettibilità. Ad esempio, il fumo di tabacco di solito contiene una notevole quantità di cadmio. Pertanto, con l'esposizione professionale al cadmio, un forte fumatore che ha accumulato quantità sostanziali di questo metallo nel corpo sarà a maggior rischio di sviluppare malattie renali correlate al cadmio.
Applicazione in medicina del lavoro
I biomarcatori sono estremamente utili nella ricerca tossicologica e molti possono essere applicabili nel monitoraggio biologico. Tuttavia, anche i limiti devono essere riconosciuti. Molti biomarcatori sono stati finora studiati solo su animali da laboratorio. I modelli tossicocinetici in altre specie potrebbero non riflettere necessariamente la situazione negli esseri umani e l'estrapolazione potrebbe richiedere studi di conferma su volontari umani. Inoltre, si deve tener conto delle variazioni individuali dovute a fattori genetici o costituzionali.
In alcuni casi, i biomarcatori di esposizione potrebbero non essere affatto fattibili (ad esempio, per sostanze chimiche che hanno vita breve in vivo). Altre sostanze chimiche possono essere immagazzinate o influenzare organi a cui non è possibile accedere con procedure di routine, come il sistema nervoso. La via di esposizione può anche influenzare il modello di distribuzione e quindi anche la misurazione del biomarcatore e la sua interpretazione. Ad esempio, è probabile che l'esposizione diretta del cervello attraverso il nervo olfattivo sfugga al rilevamento mediante la misurazione dei biomarcatori dell'esposizione. Per quanto riguarda l'effetto sui biomarcatori, molti di essi non sono affatto specifici e il cambiamento può essere dovuto a una varietà di cause, inclusi i fattori dello stile di vita. Forse in particolare con i biomarcatori di suscettibilità, l'interpretazione deve essere molto cauta al momento, poiché rimangono molte incertezze sul significato generale per la salute dei singoli genotipi.
Nella medicina del lavoro, il biomarcatore ideale dovrebbe soddisfare diversi requisiti. Prima di tutto, la raccolta e l'analisi dei campioni devono essere semplici e affidabili. Per una qualità analitica ottimale è necessaria la standardizzazione, ma i requisiti specifici variano considerevolmente. Le principali aree di interesse includono: la preparazione dell'individuo, la procedura di campionamento e la manipolazione del campione e la procedura di misurazione; quest'ultimo comprende fattori tecnici, come le procedure di calibrazione e garanzia della qualità, e fattori individuali, come l'istruzione e la formazione degli operatori.
Per la documentazione della validità analitica e della tracciabilità, i materiali di riferimento dovrebbero essere basati su matrici pertinenti e con concentrazioni adeguate di sostanze tossiche o metaboliti rilevanti a livelli appropriati. Affinché i biomarcatori vengano utilizzati per il monitoraggio biologico o per scopi diagnostici, i laboratori responsabili devono disporre di procedure analitiche ben documentate con caratteristiche prestazionali definite e registrazioni accessibili per consentire la verifica dei risultati. Allo stesso tempo, tuttavia, devono essere considerati gli aspetti economici della caratterizzazione e dell'utilizzo di materiali di riferimento per integrare le procedure di garanzia della qualità in generale. Pertanto, la qualità ottenibile dei risultati e gli usi a cui sono destinati devono essere bilanciati con i costi aggiuntivi della garanzia della qualità, compresi i materiali di riferimento, la manodopera e la strumentazione.
Un altro requisito è che il biomarcatore sia specifico, almeno nelle circostanze dello studio, per un particolare tipo di esposizione, con una chiara relazione con il grado di esposizione. In caso contrario, il risultato della misurazione del biomarcatore potrebbe essere troppo difficile da interpretare. Per una corretta interpretazione del risultato della misurazione di un biomarcatore di esposizione, deve essere nota la validità diagnostica (ovvero, la traduzione del valore del biomarcatore nell'entità dei possibili rischi per la salute). In quest'area, i metalli fungono da paradigma per la ricerca sui biomarcatori. Recenti ricerche hanno dimostrato la complessità e la sottigliezza delle relazioni dose-risposta, con notevoli difficoltà nell'identificare i livelli senza effetto e quindi anche nel definire le esposizioni tollerabili. Tuttavia, questo tipo di ricerca ha anche illustrato i tipi di indagine e il perfezionamento necessari per scoprire le informazioni rilevanti. Per la maggior parte dei composti organici non sono ancora disponibili associazioni quantitative tra le esposizioni ei corrispondenti effetti avversi sulla salute; in molti casi, anche gli organi bersaglio primari non sono noti con certezza. Inoltre, la valutazione dei dati sulla tossicità e delle concentrazioni di biomarcatori è spesso complicata dall'esposizione a miscele di sostanze, piuttosto che dall'esposizione a un singolo composto in quel momento.
Prima che il biomarcatore venga applicato a fini di salute sul lavoro, sono necessarie alcune considerazioni aggiuntive. In primo luogo, il biomarcatore deve riflettere solo un cambiamento subclinico e reversibile. In secondo luogo, dato che i risultati del biomarcatore possono essere interpretati in relazione ai rischi per la salute, dovrebbero essere disponibili sforzi preventivi e dovrebbero essere considerati realistici nel caso in cui i dati del biomarcatore suggeriscano la necessità di ridurre l'esposizione. In terzo luogo, l'uso pratico del biomarcatore deve essere generalmente considerato eticamente accettabile.
Le misure di igiene industriale possono essere confrontate con i limiti di esposizione applicabili. Allo stesso modo, i risultati sui biomarcatori di esposizione o sui biomarcatori di effetto possono essere confrontati con i limiti di azione biologica, a volte indicati come indici di esposizione biologica. Tali limiti dovrebbero essere basati sui migliori consigli di clinici e scienziati di discipline appropriate, e gli amministratori responsabili come "gestori del rischio" dovrebbero quindi tenere conto di fattori etici, sociali, culturali ed economici rilevanti. La base scientifica dovrebbe, se possibile, includere rapporti dose-risposta integrati da informazioni sulle variazioni di suscettibilità all'interno della popolazione a rischio. In alcuni paesi, i lavoratori ei membri del pubblico in generale sono coinvolti nel processo di definizione degli standard e forniscono un contributo importante, in particolare quando l'incertezza scientifica è considerevole. Una delle maggiori incertezze è come definire un effetto avverso sulla salute che dovrebbe essere prevenuto, ad esempio se la formazione di addotti come biomarcatore di esposizione rappresenti di per sé un effetto avverso (cioè un biomarcatore di effetto) che dovrebbe essere prevenuto. È probabile che sorgano questioni difficili quando si decide se sia eticamente difendibile, per lo stesso composto, avere limiti diversi per l'esposizione avventizia, da un lato, e l'esposizione professionale, dall'altro.
Le informazioni generate dall'uso dei biomarcatori dovrebbero generalmente essere trasmesse agli individui esaminati all'interno del rapporto medico-paziente. Le preoccupazioni etiche devono essere considerate in particolare in relazione alle analisi di biomarcatori altamente sperimentali che attualmente non possono essere interpretate in dettaglio in termini di effettivi rischi per la salute. Per la popolazione generale, ad esempio, attualmente esistono orientamenti limitati per quanto riguarda l'interpretazione di biomarcatori di esposizione diversi dalla concentrazione di piombo nel sangue. Altrettanto importante è la fiducia nei dati generati (vale a dire, se è stato effettuato un campionamento appropriato e se nel laboratorio coinvolto sono state utilizzate valide procedure di garanzia della qualità). Un'ulteriore area di particolare preoccupazione riguarda l'ipersensibilità individuale. Questi problemi devono essere presi in considerazione quando si fornisce il feedback dallo studio.
Tutti i settori della società interessati o interessati alla realizzazione di uno studio sui biomarcatori devono essere coinvolti nel processo decisionale su come gestire le informazioni generate dallo studio. Procedure specifiche per prevenire o superare inevitabili conflitti etici dovrebbero essere sviluppate all'interno dei quadri legali e sociali della regione o del paese. Tuttavia, ogni situazione rappresenta una serie diversa di domande e insidie e non è possibile sviluppare un'unica procedura per il coinvolgimento del pubblico per coprire tutte le applicazioni dei biomarcatori di esposizione.
La valutazione della tossicità genetica è la valutazione degli agenti per la loro capacità di indurre uno dei tre tipi generali di cambiamenti (mutazioni) nel materiale genetico (DNA): genico, cromosomico e genomico. In organismi come gli esseri umani, i geni sono composti da DNA, che consiste di singole unità chiamate basi nucleotidiche. I geni sono disposti in strutture fisiche discrete chiamate cromosomi. La genotossicità può provocare effetti significativi e irreversibili sulla salute umana. Il danno genotossico è un passaggio critico nell'induzione del cancro e può anche essere coinvolto nell'induzione di difetti alla nascita e morte fetale. Le tre classi di mutazioni sopra menzionate possono verificarsi all'interno di uno dei due tipi di tessuti posseduti da organismi come gli esseri umani: spermatozoi o uova (cellule germinali) e il tessuto rimanente (cellule somatiche).
I test che misurano la mutazione genica sono quelli che rilevano la sostituzione, l'aggiunta o la delezione di nucleotidi all'interno di un gene. I test che misurano la mutazione cromosomica sono quelli che rilevano rotture o riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono uno o più cromosomi. I test che misurano la mutazione genomica sono quelli che rilevano i cambiamenti nel numero di cromosomi, una condizione chiamata aneuploidia. La valutazione della tossicità genetica è cambiata notevolmente dallo sviluppo da parte di Herman Muller nel 1927 del primo test per rilevare agenti genotossici (mutageni). Da allora sono stati sviluppati più di 200 test che misurano le mutazioni nel DNA; tuttavia, oggi vengono utilizzati comunemente meno di dieci test per la valutazione della tossicità genetica. Questo articolo esamina questi test, descrive ciò che misurano ed esplora il ruolo di questi test nella valutazione della tossicità.
Identificazione dei rischi di cancroPrima dello sviluppo del Campo di tossicologia genetica
La tossicologia genetica è diventata parte integrante del processo complessivo di valutazione del rischio e negli ultimi tempi ha guadagnato importanza come predittore affidabile dell'attività cancerogena. Tuttavia, prima dello sviluppo della tossicologia genetica (prima del 1970), altri metodi erano e sono tuttora utilizzati per identificare potenziali rischi di cancro per l'uomo. Esistono sei principali categorie di metodi attualmente utilizzati per identificare i rischi di cancro nell'uomo: studi epidemiologici, saggi biologici in vivo a lungo termine, saggi biologici in vivo a medio termine, saggi biologici in vivo e in vitro a breve termine, intelligenza artificiale (struttura-attività), e inferenza basata sui meccanismi.
La tabella 1 fornisce vantaggi e svantaggi per questi metodi.
Tabella 1. Vantaggi e svantaggi dei metodi attuali per l'identificazione dei rischi di cancro nell'uomo
Vantaggi | Svantaggi | |
Studi epidemiologici | (1) gli esseri umani sono i massimi indicatori di malattia; (2) valutare le popolazioni sensibili o suscettibili; (3) coorti di esposizione professionale; (4) allarmi sentinella ambientale |
(1) generalmente retrospettivo (certificati di morte, bias di richiamo, ecc.); (2) insensibile, costoso, lungo; (3) dati affidabili sull'esposizione a volte non disponibili o difficili da ottenere; (4) esposizioni combinate, multiple e complesse; mancanza di adeguate coorti di controllo; (5) esperimenti sugli esseri umani non fatti; (6) rilevamento del cancro, non prevenzione |
Saggi biologici in vivo a lungo termine | (1) valutazioni prospettiche e retrospettive (convalida); (2) eccellente correlazione con cancerogeni umani identificati; (3) livelli e condizioni di esposizione noti; (4) identifica la tossicità chimica e gli effetti cancerogeni; (5) risultati ottenuti in tempi relativamente brevi; (6) confronti qualitativi tra classi chimiche; (7) sistemi biologici integrativi e interattivi strettamente legati all'uomo | (1) raramente replicato, ad alta intensità di risorse; (3) strutture limitate adatte a tali esperimenti; (4) dibattito sull'estrapolazione delle specie; (5) le esposizioni utilizzate sono spesso a livelli di gran lunga superiori a quelli sperimentati dall'uomo; (6) l'esposizione a una singola sostanza chimica non imita l'esposizione umana, che generalmente avviene a più sostanze chimiche contemporaneamente |
Saggi biologici in vivo e in vitro a medio e breve termine | (1) più rapido e meno costoso di altri test; (2) grandi campioni facilmente replicabili; (3) vengono misurati i punti finali biologicamente significativi (mutazione, ecc.); (4) può essere utilizzato come analisi di screening per selezionare sostanze chimiche per analisi biologiche a lungo termine |
(1) in vitro non completamente predittivo di in vivo; (2) solitamente organismo o organo specifico; (3) potenze non paragonabili a animali interi o umani |
Associazioni struttura chimica-attività biologica | (1) relativamente facile, rapido e poco costoso; (2) affidabile per alcune classi chimiche (ad esempio, nitrosammine e coloranti benzidinici); (3) sviluppato da dati biologici ma non dipendente da ulteriori sperimentazioni biologiche | (1) non "biologico"; (2) molte eccezioni alle regole formulate; (3) retrospettiva e raramente (ma diventa) prospettica |
Inferenze basate sui meccanismi | (1) ragionevolmente accurato per determinate classi di sostanze chimiche; (2) consente di perfezionare le ipotesi; (3) può orientare le valutazioni del rischio verso popolazioni sensibili | (1) meccanismi di cancerogenesi chimica indefiniti, multipli e probabilmente chimici o specifici per classe; (2) può non evidenziare eccezioni ai meccanismi generali |
Basi razionali e concettuali per saggi di tossicologia genetica
Sebbene i tipi e i numeri esatti dei test utilizzati per la valutazione della tossicità genetica siano in continua evoluzione e varino da paese a paese, i più comuni includono test per (1) mutazione genica in batteri e/o cellule di mammifero in coltura e (2) mutazione cromosomica in cellule di mammifero in coltura e/o midollo osseo all'interno di topi viventi. Alcuni dei test all'interno di questa seconda categoria possono anche rilevare l'aneuploidia. Sebbene questi test non rilevino mutazioni nelle cellule germinali, vengono utilizzati principalmente a causa del costo aggiuntivo e della complessità dell'esecuzione dei test delle cellule germinali. Tuttavia, i test delle cellule germinali nei topi vengono utilizzati quando si desiderano informazioni sugli effetti delle cellule germinali.
Studi sistematici su un periodo di 25 anni (1970-1995), in particolare presso il National Toxicology Program degli Stati Uniti nella Carolina del Nord, hanno portato all'uso di un numero discreto di test per rilevare l'attività mutagena degli agenti. Il fondamento logico per valutare l'utilità dei saggi si basava sulla loro capacità di rilevare agenti che causano il cancro nei roditori e che si sospetta causino il cancro nell'uomo (cioè agenti cancerogeni). Questo perché gli studi degli ultimi decenni hanno indicato che le cellule tumorali contengono mutazioni in alcuni geni e che molti agenti cancerogeni sono anche mutageni. Pertanto, le cellule tumorali sono viste come contenenti mutazioni delle cellule somatiche e la cancerogenesi è vista come un tipo di mutagenesi delle cellule somatiche.
I test di tossicità genetica utilizzati più comunemente oggi sono stati selezionati non solo per il loro ampio database, il costo relativamente basso e la facilità di esecuzione, ma perché hanno dimostrato di rilevare molti roditori e, presumibilmente, agenti cancerogeni per l'uomo. Di conseguenza, i test di tossicità genetica vengono utilizzati per prevedere la potenziale cancerogenicità degli agenti.
Un importante sviluppo concettuale e pratico nel campo della tossicologia genetica è stato il riconoscimento che molti cancerogeni sono stati modificati dagli enzimi all'interno del corpo, creando forme alterate (metaboliti) che erano spesso la forma cancerogena e mutagena definitiva della sostanza chimica madre. Per duplicare questo metabolismo in una capsula di Petri, Heinrich Malling ha dimostrato che l'inclusione di un preparato di fegato di roditore conteneva molti degli enzimi necessari per eseguire questa conversione o attivazione metabolica. Pertanto, molti test di tossicità genetica eseguiti in piastre o provette (in vitro) impiegano l'aggiunta di preparazioni enzimatiche simili. Le preparazioni semplici sono chiamate mix S9 e le preparazioni purificate sono chiamate microsomi. Alcune cellule batteriche e di mammifero sono state ora geneticamente modificate per contenere alcuni dei geni di roditori o umani che producono questi enzimi, riducendo la necessità di aggiungere mix S9 o microsomi.
Saggi e tecniche di tossicologia genetica
I principali sistemi batterici utilizzati per lo screening della tossicità genetica sono il saggio di mutagenicità Salmonella (Ames) e, in misura molto minore, il ceppo WP2 di Escherichia coli. Gli studi della metà degli anni '1980 hanno indicato che l'uso di soli due ceppi del sistema Salmonella (TA98 e TA100) era sufficiente per rilevare circa il 90% dei mutageni conosciuti di Salmonella. Pertanto, questi due ceppi vengono utilizzati per la maggior parte degli scopi di screening; tuttavia, sono disponibili vari altri ceppi per test più approfonditi.
Questi saggi vengono eseguiti in vari modi, ma due procedure generali sono i saggi di incorporazione su piastra e di sospensione liquida. Nel saggio di incorporazione su piastra, le cellule, la sostanza chimica in esame e (se desiderato) l'S9 vengono aggiunti insieme in un agar liquefatto e versati sulla superficie di una piastra di agar petri. L'agar superiore si indurisce in pochi minuti e le piastre vengono incubate per due o tre giorni, dopodiché le cellule mutanti sono cresciute per formare gruppi di cellule visivamente rilevabili chiamate colonie, che vengono poi contate. Il terreno di agar contiene agenti selettivi o è composto da ingredienti tali che cresceranno solo le cellule appena mutate. Il test di incubazione con liquido è simile, tranne per il fatto che le cellule, l'agente del test e l'S9 vengono incubati insieme in un liquido che non contiene agar liquefatto, quindi le cellule vengono lavate via dall'agente del test e dall'S9 e seminate sull'agar.
Le mutazioni nelle cellule di mammifero in coltura vengono rilevate principalmente in uno dei due geni: hprt e tk. Analogamente ai saggi batterici, le linee cellulari di mammifero (sviluppate da roditori o cellule umane) vengono esposte all'agente di prova in piastre o provette di coltura di plastica e quindi vengono seminate in piastre di coltura che contengono terreno con un agente selettivo che consente solo alle cellule mutanti di crescere . I saggi utilizzati a questo scopo includono il CHO/HPRT, il TK6 e il linfoma di topo L5178Y/TK+/- saggi. Vengono utilizzate anche altre linee cellulari contenenti varie mutazioni di riparazione del DNA e contenenti alcuni geni umani coinvolti nel metabolismo. Questi sistemi consentono il recupero di mutazioni all'interno del gene (mutazione genica) così come mutazioni che coinvolgono regioni del cromosoma che fiancheggiano il gene (mutazione cromosomica). Tuttavia, quest'ultimo tipo di mutazione viene recuperato in misura molto maggiore dal tk sistemi genici che dal hprt sistemi genici a causa della posizione del tk scomodo.
Analogamente al saggio di incubazione in liquido per la mutagenicità batterica, i saggi di mutagenicità su cellule di mammifero comportano generalmente l'esposizione delle cellule in piastre o provette di coltura in presenza dell'agente in esame e S9 per diverse ore. Le cellule vengono quindi lavate, coltivate per diversi giorni per consentire la degradazione dei prodotti genici normali (wild-type) e l'espressione e l'accumulo dei nuovi prodotti genici mutanti, quindi vengono seminate in un terreno contenente un agente selettivo che consente solo le cellule mutanti a crescere. Come i test batterici, le cellule mutanti crescono in colonie visivamente rilevabili che vengono poi contate.
La mutazione cromosomica è identificata principalmente mediante analisi citogenetiche, che comportano l'esposizione di roditori e/o cellule di roditori o umane in piastre di coltura a una sostanza chimica in esame, consentendo il verificarsi di una o più divisioni cellulari, la colorazione dei cromosomi e quindi l'esame visivo dei cromosomi attraverso un microscopio per rilevare alterazioni nella struttura o nel numero di cromosomi. Sebbene sia possibile esaminare una varietà di endpoint, i due attualmente accettati dalle agenzie di regolamentazione come i più significativi sono le aberrazioni cromosomiche e una sottocategoria chiamata micronuclei.
Sono necessarie una notevole formazione ed esperienza per valutare le cellule per la presenza di aberrazioni cromosomiche, rendendo questa procedura costosa in termini di tempo e denaro. Al contrario, i micronuclei richiedono poco addestramento e il loro rilevamento può essere automatizzato. I micronuclei appaiono come piccoli punti all'interno della cellula che sono distinti dal nucleo, che contiene i cromosomi. I micronuclei derivano dalla rottura del cromosoma o dall'aneuploidia. A causa della facilità di scoring dei micronuclei rispetto alle aberrazioni cromosomiche, e poiché studi recenti indicano che gli agenti che inducono aberrazioni cromosomiche nel midollo osseo di topi viventi generalmente inducono micronuclei in questo tessuto, i micronuclei sono ora comunemente misurati come un'indicazione della capacità di un agente per indurre la mutazione cromosomica.
Sebbene i test sulle cellule germinali siano utilizzati molto meno frequentemente rispetto agli altri test sopra descritti, sono indispensabili per determinare se un agente rappresenta un rischio per le cellule germinali, le cui mutazioni possono portare a effetti sulla salute nelle generazioni successive. I test delle cellule germinali più comunemente usati sono nei topi e coinvolgono sistemi che rilevano (1) traslocazioni ereditabili (scambi) tra i cromosomi (test di traslocazione ereditaria), (2) mutazioni geniche o cromosomiche che coinvolgono geni specifici (specifico visibile o biochimico-locus saggi) e (3) mutazioni che influenzano la vitalità (dosaggio letale dominante). Come per i saggi sulle cellule somatiche, il presupposto di lavoro con i saggi sulle cellule germinali è che si presume che gli agenti positivi in questi saggi siano potenziali mutageni delle cellule germinali umane.
Stato attuale e prospettive future
Studi recenti hanno indicato che erano necessarie solo tre informazioni per rilevare circa il 90% di un insieme di 41 cancerogeni per roditori (cioè presunti cancerogeni per l'uomo e mutageni delle cellule somatiche). Questi includevano (1) la conoscenza della struttura chimica dell'agente, specialmente se contiene frazioni elettrofile (vedere la sezione sulle relazioni struttura-attività); (2) dati sulla mutagenicità della Salmonella; e (3) dati da un test di tossicità cronica di 90 giorni nei roditori (topi e ratti). In effetti, essenzialmente tutti gli agenti cancerogeni per l'uomo dichiarati dalla IARC sono rilevabili come mutageni utilizzando solo il test Salmonella e il test del micronucleo del midollo osseo di topo. L'uso di questi test di mutagenicità per rilevare potenziali agenti cancerogeni per l'uomo è ulteriormente supportato dalla scoperta che la maggior parte degli agenti cancerogeni per l'uomo è cancerogena sia nei ratti che nei topi (cancerogeni transspecie) e che la maggior parte degli agenti cancerogeni transspecie è mutagena nella Salmonella e/o induce micronuclei nel midollo osseo del topo.
Con i progressi nella tecnologia del DNA, il progetto sul genoma umano e una migliore comprensione del ruolo della mutazione nel cancro, si stanno sviluppando nuovi test di genotossicità che saranno probabilmente incorporati nelle procedure di screening standard. Tra questi c'è l'uso di cellule transgeniche e di roditori. I sistemi transgenici sono quelli in cui un gene di un'altra specie è stato introdotto in una cellula o in un organismo. Ad esempio, i topi transgenici sono ora in uso sperimentale che consentono il rilevamento della mutazione in qualsiasi organo o tessuto dell'animale, sulla base dell'introduzione di un gene batterico nel topo. Sono ora disponibili cellule batteriche, come Salmonella, e cellule di mammifero (comprese linee cellulari umane) che contengono geni coinvolti nel metabolismo di agenti cancerogeni/mutageni, come i geni P450. Analisi molecolare delle effettive mutazioni indotte nel transgene all'interno di roditori transgenici o all'interno di geni nativi come hprt, oppure è ora possibile analizzare i geni bersaglio all'interno della Salmonella, in modo da poter determinare l'esatta natura delle mutazioni indotte dalle sostanze chimiche, fornendo informazioni sul meccanismo d'azione della sostanza chimica e consentendo confronti con le mutazioni negli esseri umani presumibilmente esposti all'agente .
I progressi molecolari nella citogenetica ora consentono una valutazione più dettagliata delle mutazioni cromosomiche. Questi includono l'uso di sonde (piccoli pezzi di DNA) che si attaccano (ibridano) a geni specifici. I riarrangiamenti dei geni sul cromosoma possono quindi essere rivelati dalla posizione alterata delle sonde, che sono fluorescenti e facilmente visualizzabili come settori colorati sui cromosomi. Il test di elettroforesi su gel a singola cellula per la rottura del DNA (comunemente chiamato test "cometa") consente il rilevamento di rotture del DNA all'interno di singole cellule e può diventare uno strumento estremamente utile in combinazione con tecniche citogenetiche per rilevare il danno cromosomico.
Dopo molti anni di utilizzo e la generazione di un database ampio e sviluppato in modo sistematico, la valutazione della tossicità genetica può ora essere eseguita con pochi test a costi relativamente ridotti in un breve periodo di tempo (poche settimane). I dati prodotti possono essere utilizzati per prevedere la capacità di un agente di essere un roditore e, presumibilmente, cancerogeno per l'uomo/mutageno di cellule somatiche. Tale capacità consente di limitare l'introduzione nell'ambiente di agenti mutageni e cancerogeni e di sviluppare agenti alternativi non mutageni. Gli studi futuri dovrebbero portare a metodi ancora migliori con una maggiore predittività rispetto ai test attuali.
L'emergere di sofisticate tecnologie nella biologia molecolare e cellulare ha stimolato un'evoluzione relativamente rapida nelle scienze della vita, compresa la tossicologia. In effetti, l'attenzione della tossicologia si sta spostando da interi animali e popolazioni di interi animali alle cellule e alle molecole di singoli animali e umani. Dalla metà degli anni '1980, i tossicologi hanno iniziato a impiegare queste nuove metodologie per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui sistemi viventi. Come logica progressione, tali metodi vengono adattati ai fini dei test di tossicità. Questi progressi scientifici hanno collaborato con fattori sociali ed economici per modificare la valutazione della sicurezza del prodotto e del rischio potenziale.
I fattori economici sono specificamente legati al volume dei materiali che devono essere testati. Ogni anno viene introdotta sul mercato una miriade di nuovi cosmetici, prodotti farmaceutici, pesticidi, prodotti chimici e prodotti per la casa. Tutti questi prodotti devono essere valutati per la loro potenziale tossicità. Inoltre, vi è un arretrato di prodotti chimici già in uso che non sono stati adeguatamente testati. L'enorme compito di ottenere informazioni dettagliate sulla sicurezza di tutte queste sostanze chimiche utilizzando i tradizionali metodi di sperimentazione su animali interi sarebbe costoso in termini sia di denaro che di tempo, se potesse essere portato a termine.
Esistono anche questioni sociali che riguardano la salute e la sicurezza pubblica, nonché una crescente preoccupazione del pubblico sull'uso di animali per i test sulla sicurezza dei prodotti. Per quanto riguarda la sicurezza umana, l'interesse pubblico e i gruppi di difesa dell'ambiente hanno esercitato pressioni significative sulle agenzie governative affinché applicassero normative più rigorose sulle sostanze chimiche. Un recente esempio di ciò è stato un movimento di alcuni gruppi ambientalisti per vietare il cloro e i composti contenenti cloro negli Stati Uniti. Una delle motivazioni di un'azione così estrema risiede nel fatto che la maggior parte di questi composti non è mai stata adeguatamente testata. Dal punto di vista tossicologico, il concetto di vietare un'intera classe di sostanze chimiche diverse basato semplicemente sulla presenza di cloro è sia scientificamente infondato che irresponsabile. Tuttavia, è comprensibile che, dal punto di vista del pubblico, ci debba essere una certa garanzia che le sostanze chimiche rilasciate nell'ambiente non comportino un rischio significativo per la salute. Tale situazione sottolinea la necessità di metodi più efficienti e rapidi per valutare la tossicità.
L'altra preoccupazione della società che ha avuto un impatto sull'area dei test di tossicità è il benessere degli animali. Il numero crescente di gruppi per la protezione degli animali in tutto il mondo ha espresso una notevole opposizione all'uso di animali interi per i test sulla sicurezza dei prodotti. Sono state condotte campagne attive contro i produttori di cosmetici, prodotti per la cura della casa e della persona e prodotti farmaceutici nel tentativo di fermare i test sugli animali. Tali sforzi in Europa hanno portato all'approvazione del sesto emendamento alla direttiva 76/768/CEE (la direttiva sui cosmetici). La conseguenza di questa direttiva è che i prodotti cosmetici o gli ingredienti cosmetici che sono stati testati sugli animali dopo il 1° gennaio 1998 non possono essere commercializzati nell'Unione Europea, a meno che metodi alternativi non siano sufficientemente convalidati. Sebbene questa direttiva non abbia giurisdizione sulla vendita di tali prodotti negli Stati Uniti o in altri paesi, influirà in modo significativo sulle società che hanno mercati internazionali che includono l'Europa.
Il concetto di alternative, che costituisce la base per lo sviluppo di test diversi da quelli su animali interi, è definito dai tre Rs: riduzione nel numero di animali utilizzati; raffinatezza di protocolli in modo che gli animali provino meno stress o disagio; e sostituzione degli attuali test sugli animali con test in vitro (cioè test eseguiti al di fuori dell'animale vivente), modelli computerizzati o test su specie di vertebrati o invertebrati inferiori. I tre Rs sono stati introdotti in un libro pubblicato nel 1959 da due scienziati britannici, WMS Russell e Rex Burch, I principi della tecnica sperimentale umana. Russell e Burch sostenevano che l'unico modo per ottenere risultati scientifici validi fosse attraverso il trattamento umano degli animali e ritenevano che si dovessero sviluppare metodi per ridurre l'uso di animali e alla fine sostituirlo. È interessante notare che i principi delineati da Russell e Burch hanno ricevuto poca attenzione fino alla rinascita del movimento per il benessere degli animali a metà degli anni '1970. Oggi il concetto dei tre Rs è all'avanguardia per quanto riguarda la ricerca, i test e l'istruzione.
In sintesi, lo sviluppo delle metodologie di test in vitro è stato influenzato da una varietà di fattori che sono confluiti negli ultimi dieci o vent'anni. È difficile accertare se qualcuno di questi fattori da solo avrebbe avuto un effetto così profondo sulle strategie dei test di tossicità.
Concetto di test di tossicità in vitro
Questa sezione si concentrerà esclusivamente sui metodi in vitro per valutare la tossicità, come una delle alternative alla sperimentazione su animali interi. Ulteriori alternative non animali come la modellazione al computer e le relazioni quantitative struttura-attività sono discusse in altri articoli di questo capitolo.
Gli studi in vitro sono generalmente condotti su cellule o tessuti animali o umani al di fuori del corpo. In vitro significa letteralmente "in vetro" e si riferisce a procedure eseguite su materiale vivo o componenti di materiale vivo coltivate in capsule di Petri o in provette in condizioni definite. Questi possono essere messi a confronto con gli studi in vivo, o con quelli effettuati “nell'animale vivente”. Sebbene sia difficile, se non impossibile, proiettare gli effetti di una sostanza chimica su un organismo complesso quando le osservazioni sono limitate a un singolo tipo di cellule in una piastra, gli studi in vitro forniscono anche una quantità significativa di informazioni sulla tossicità intrinseca. come meccanismi cellulari e molecolari di tossicità. Inoltre, offrono molti vantaggi rispetto agli studi in vivo in quanto sono generalmente meno costosi e possono essere condotti in condizioni più controllate. Inoltre, nonostante il fatto che sia ancora necessario un piccolo numero di animali per ottenere cellule per colture in vitro, questi metodi possono essere considerati alternative di riduzione (poiché vengono utilizzati molti meno animali rispetto agli studi in vivo) e alternative di raffinamento (perché eliminano la necessità sottoporre gli animali alle conseguenze tossiche avverse imposte dagli esperimenti in vivo).
Per interpretare i risultati dei test di tossicità in vitro, determinarne la potenziale utilità nella valutazione della tossicità e metterli in relazione con il processo tossicologico complessivo in vivo, è necessario comprendere quale parte del processo tossicologico si sta esaminando. L'intero processo tossicologico è costituito da eventi che iniziano con l'esposizione dell'organismo a un agente fisico o chimico, progrediscono attraverso interazioni cellulari e molecolari e si manifestano infine nella risposta dell'intero organismo. I test in vitro sono generalmente limitati alla parte del processo tossicologico che avviene a livello cellulare e molecolare. I tipi di informazioni che possono essere ottenuti dagli studi in vitro includono le vie del metabolismo, l'interazione dei metaboliti attivi con i bersagli cellulari e molecolari e gli endpoint tossici potenzialmente misurabili che possono fungere da biomarcatori molecolari per l'esposizione. In una situazione ideale, sarebbe noto il meccanismo di tossicità di ciascuna sostanza chimica dall'esposizione alla manifestazione dell'organismo, in modo tale che le informazioni ottenute dai test in vitro possano essere completamente interpretate e correlate alla risposta dell'intero organismo. Tuttavia, questo è praticamente impossibile, poiché sono stati chiariti relativamente pochi meccanismi tossicologici completi. Pertanto, i tossicologi si trovano di fronte a una situazione in cui i risultati di un test in vitro non possono essere utilizzati come previsione del tutto accurata della tossicità in vivo perché il meccanismo è sconosciuto. Tuttavia, spesso durante il processo di sviluppo di un test in vitro, vengono chiariti i componenti dei meccanismi cellulari e molecolari della tossicità.
Una delle principali questioni irrisolte che circondano lo sviluppo e l'implementazione dei test in vitro è legata alla seguente considerazione: dovrebbero essere basati meccanicamente o è sufficiente che siano descrittivi? È indiscutibilmente meglio da un punto di vista scientifico utilizzare solo test meccanicistici come sostituti dei test in vivo. Tuttavia, in assenza di una conoscenza meccanicistica completa, la prospettiva di sviluppare test in vitro per sostituire completamente i test su animali interi nel prossimo futuro è quasi nulla. Ciò, tuttavia, non esclude l'uso di tipi di test più descrittivi come strumenti di screening precoce, come avviene attualmente. Questi schermi hanno portato a una significativa riduzione dell'uso di animali. Pertanto, fino a quando non verranno generate più informazioni meccanicistiche, potrebbe essere necessario impiegare in misura più limitata test i cui risultati si correlano semplicemente bene con quelli ottenuti in vivo.
Test in vitro per la citotossicità
In questa sezione verranno descritti diversi test in vitro che sono stati sviluppati per valutare il potenziale citotossico di una sostanza chimica. Per la maggior parte, questi test sono facili da eseguire e l'analisi può essere automatizzata. Un test in vitro comunemente usato per la citotossicità è il test del rosso neutro. Questo test viene eseguito su cellule in coltura e, per la maggior parte delle applicazioni, le cellule possono essere mantenute in piastre di coltura che contengono 96 piccoli pozzetti, ciascuno di 6.4 mm di diametro. Poiché ciascun pozzetto può essere utilizzato per una singola determinazione, questa disposizione può contenere più concentrazioni della sostanza chimica in esame nonché controlli positivi e negativi con un numero sufficiente di repliche per ciascuno. Dopo il trattamento delle cellule con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame comprese in almeno due ordini di grandezza (ad esempio, da 0.01 mM a 1 mM), nonché sostanze chimiche di controllo positive e negative, le cellule vengono risciacquate e trattate con rosso neutro, un colorante che può essere assorbito e trattenuto solo dalle cellule vive. Il colorante può essere aggiunto alla rimozione della sostanza chimica in esame per determinare gli effetti immediati, oppure può essere aggiunto in momenti diversi dopo la rimozione della sostanza chimica in esame per determinare effetti cumulativi o ritardati. L'intensità del colore in ogni pozzetto corrisponde al numero di cellule vive in quel pozzetto. L'intensità del colore è misurata da uno spettrofotometro che può essere dotato di un lettore di lastre. Il lettore di piastre è programmato per fornire misurazioni individuali per ciascuno dei 96 pozzetti della piastra di coltura. Questa metodologia automatizzata consente allo sperimentatore di eseguire rapidamente un esperimento concentrazione-risposta e di ottenere dati statisticamente utili.
Un altro test relativamente semplice per la citotossicità è il test MTT. MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro) è un colorante tetrazolio che viene ridotto dagli enzimi mitocondriali a un colore blu. Solo le cellule con mitocondri vitali manterranno la capacità di eseguire questa reazione; pertanto l'intensità del colore è direttamente correlata al grado di integrità mitocondriale. Questo è un test utile per rilevare composti citotossici generali così come quegli agenti che prendono di mira specificamente i mitocondri.
La misurazione dell'attività della lattato deidrogenasi (LDH) viene utilizzata anche come test ad ampio raggio per la citotossicità. Questo enzima è normalmente presente nel citoplasma delle cellule viventi e viene rilasciato nel mezzo di coltura cellulare attraverso membrane cellulari che perdono di cellule morte o morenti che sono state influenzate negativamente da un agente tossico. Piccole quantità di terreno di coltura possono essere rimosse in vari momenti dopo il trattamento chimico delle cellule per misurare la quantità di LDH rilasciata e determinare un andamento temporale della tossicità. Sebbene il test di rilascio di LDH sia una valutazione molto generale della citotossicità, è utile perché è facile da eseguire e può essere eseguito in tempo reale.
Ci sono molti nuovi metodi in fase di sviluppo per rilevare il danno cellulare. Metodi più sofisticati impiegano sonde fluorescenti per misurare una varietà di parametri intracellulari, come il rilascio di calcio e le variazioni del pH e del potenziale di membrana. In generale, queste sonde sono molto sensibili e possono rilevare cambiamenti cellulari più sottili, riducendo così la necessità di utilizzare la morte cellulare come endpoint. Inoltre, molti di questi saggi fluorescenti possono essere automatizzati mediante l'uso di piastre a 96 pozzetti e lettori di piastre fluorescenti.
Una volta raccolti i dati su una serie di sostanze chimiche utilizzando uno di questi test, è possibile determinare le relative tossicità. La tossicità relativa di una sostanza chimica, determinata in un test in vitro, può essere espressa come la concentrazione che esercita un effetto del 50% sulla risposta finale delle cellule non trattate. Questa determinazione è indicata come CE50 (Effective Cconcentrazione per 50% delle cellule) e può essere utilizzato per confrontare le tossicità di diverse sostanze chimiche in vitro. (Un termine simile utilizzato per valutare la tossicità relativa è IC50, che indica la concentrazione di una sostanza chimica che provoca un'inibizione del 50% di un processo cellulare, ad esempio la capacità di assorbire il rosso neutro.) Non è facile valutare se la relativa tossicità in vitro delle sostanze chimiche sia paragonabile alla loro relativa tossicità in vivo, poiché ci sono così tanti fattori di confusione nel sistema in vivo, come la tossicocinetica, il metabolismo, i meccanismi di riparazione e difesa. Inoltre, poiché la maggior parte di questi test misura gli endpoint generali di citotossicità, non sono basati meccanicamente. Pertanto, l'accordo tra tossicità relative in vitro e in vivo è semplicemente correlativo. Nonostante le numerose complessità e difficoltà di estrapolazione da in vitro a in vivo, questi test in vitro si stanno rivelando molto preziosi perché sono semplici e poco costosi da eseguire e possono essere utilizzati come screening per segnalare farmaci o sostanze chimiche altamente tossiche nelle prime fasi di sviluppo.
Tossicità per gli organi bersaglio
I test in vitro possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità specifica per organi bersaglio. Ci sono una serie di difficoltà associate alla progettazione di tali test, la più notevole è l'incapacità dei sistemi in vitro di mantenere molte delle caratteristiche dell'organo in vivo. Spesso, quando le cellule vengono prelevate da animali e poste in coltura, tendono a degenerare rapidamente e/oa dedifferenziarsi, cioè a perdere le loro funzioni organiche ea diventare più generiche. Ciò presenta un problema in quanto entro un breve periodo di tempo, di solito pochi giorni, le colture non sono più utili per valutare gli effetti organo-specifici di una tossina.
Molti di questi problemi vengono superati grazie ai recenti progressi nella biologia molecolare e cellulare. Le informazioni ottenute sull'ambiente cellulare in vivo possono essere utilizzate nella modulazione delle condizioni di coltura in vitro. Dalla metà degli anni '1980 sono stati scoperti nuovi fattori di crescita e citochine, e molti di questi sono ora disponibili in commercio. L'aggiunta di questi fattori alle cellule in coltura aiuta a preservarne l'integrità e può anche aiutare a mantenere funzioni più differenziate per periodi di tempo più lunghi. Altri studi di base hanno accresciuto la conoscenza dei fabbisogni nutrizionali e ormonali delle cellule in coltura, così da poter formulare nuovi terreni. Sono stati compiuti recenti progressi anche nell'identificazione di matrici extracellulari sia naturali che artificiali su cui le cellule possono essere coltivate. La coltura di cellule su queste diverse matrici può avere effetti profondi sia sulla loro struttura che sulla loro funzione. Un grande vantaggio derivato da questa conoscenza è la capacità di controllare in modo complesso l'ambiente delle cellule in coltura ed esaminare individualmente gli effetti di questi fattori sui processi cellulari di base e sulle loro risposte a diversi agenti chimici. In breve, questi sistemi possono fornire una visione approfondita dei meccanismi di tossicità specifici degli organi.
Molti studi sulla tossicità degli organi bersaglio sono condotti su cellule primarie, che per definizione sono appena isolate da un organo e di solito mostrano una durata limitata in coltura. Ci sono molti vantaggi nell'avere colture primarie di un singolo tipo cellulare da un organo per la valutazione della tossicità. Da una prospettiva meccanicistica, tali colture sono utili per studiare specifici bersagli cellulari di una sostanza chimica. In alcuni casi, due o più tipi di cellule di un organo possono essere coltivati insieme, e questo fornisce un ulteriore vantaggio di poter osservare le interazioni cellula-cellula in risposta a una tossina. Alcuni sistemi di co-coltura per la pelle sono stati progettati in modo da formare una struttura tridimensionale simile alla pelle in vivo. È anche possibile co-coltivare cellule di organi diversi, ad esempio fegato e reni. Questo tipo di coltura sarebbe utile per valutare gli effetti specifici sulle cellule renali, di una sostanza chimica che deve essere bioattivata nel fegato.
Anche gli strumenti biologici molecolari hanno svolto un ruolo importante nello sviluppo di linee cellulari continue che possono essere utili per i test di tossicità degli organi bersaglio. Queste linee cellulari sono generate trasfettando il DNA in cellule primarie. Nella procedura di trasfezione, le cellule e il DNA vengono trattati in modo tale che il DNA possa essere assorbito dalle cellule. Il DNA di solito proviene da un virus e contiene uno o più geni che, quando espressi, consentono alle cellule di diventare immortali (cioè in grado di vivere e crescere per lunghi periodi di tempo in coltura). Il DNA può anche essere ingegnerizzato in modo che il gene immortalizzante sia controllato da un promotore inducibile. Il vantaggio di questo tipo di costrutto è che le cellule si dividono solo quando ricevono lo stimolo chimico appropriato per consentire l'espressione del gene immortalizzante. Un esempio di tale costrutto è il grande gene dell'antigene T del Simian Virus 40 (SV40) (il gene immortalizzante), preceduto dalla regione del promotore del gene della metallotioneina, che è indotto dalla presenza di un metallo nel mezzo di coltura. Pertanto, dopo che il gene è stato trasfettato nelle cellule, le cellule possono essere trattate con basse concentrazioni di zinco per stimolare il promotore MT e attivare l'espressione del gene dell'antigene T. In queste condizioni, le cellule proliferano. Quando lo zinco viene rimosso dal mezzo, le cellule smettono di dividersi e in condizioni ideali ritornano a uno stato in cui esprimono le loro funzioni tessuto-specifiche.
La capacità di generare cellule immortalizzate combinata con i progressi nella tecnologia delle colture cellulari ha contribuito notevolmente alla creazione di linee cellulari da molti organi diversi, tra cui cervello, reni e fegato. Tuttavia, prima che queste linee cellulari possano essere utilizzate come surrogato per i tipi di cellule in buona fede, devono essere caratterizzate attentamente per determinare quanto siano realmente "normali".
Altri sistemi in vitro per lo studio della tossicità degli organi bersaglio comportano una crescente complessità. Man mano che i sistemi in vitro progrediscono in complessità dalla singola cellula alla coltura dell'intero organo, diventano più paragonabili all'ambiente in vivo, ma allo stesso tempo diventano molto più difficili da controllare dato l'aumento del numero di variabili. Pertanto, ciò che può essere guadagnato nel passaggio a un livello superiore di organizzazione può essere perso nell'incapacità del ricercatore di controllare l'ambiente sperimentale. La tabella 1 confronta alcune delle caratteristiche di vari sistemi in vitro che sono stati utilizzati per studiare l'epatotossicità.
Tabella 1. Confronto dei sistemi in vitro per gli studi di epatotossicità
Sistema | Complessità (livello di interazione) |
Capacità di mantenere le funzioni specifiche del fegato | Durata potenziale della cultura | Capacità di controllare l'ambiente |
Linee cellulari immortalizzate | da cella a cella (varia con la linea cellulare) | da scarso a buono (varia con la linea cellulare) | indefinito | eccellente |
Colture primarie di epatociti | cellula a cellula | da discreto a eccellente (varia a seconda delle condizioni colturali) | giorni a settimane | eccellente |
Co-colture di cellule epatiche | da cella a cella (tra lo stesso tipo di cella e diversi) | da buono a fantastico | settimana | eccellente |
Fettine di fegato | da cella a cella (tra tutti i tipi di cella) | da buono a fantastico | ore to giorni | buono |
Fegato isolato e perfuso | da cellula a cellula (tra tutti i tipi di cellule) e intra-organo | eccellente | ore | fiera |
Le fette di tessuto tagliate con precisione vengono utilizzate più ampiamente per gli studi tossicologici. Sono disponibili nuovi strumenti che consentono al ricercatore di tagliare fette di tessuto uniforme in un ambiente sterile. Le fette di tessuto offrono qualche vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule dell'organo e mantengono la loro architettura in vivo e la comunicazione intercellulare. Pertanto, possono essere condotti studi in vitro per determinare il tipo di cellula bersaglio all'interno di un organo nonché per studiare la tossicità specifica dell'organo bersaglio. Uno svantaggio delle fettine è che degenerano rapidamente dopo le prime 24 ore di coltura, principalmente a causa della scarsa diffusione dell'ossigeno alle cellule all'interno delle fettine. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che è possibile ottenere un'aerazione più efficiente mediante una leggera rotazione. Questo, insieme all'uso di un mezzo più complesso, consente alle fette di sopravvivere fino a 96 ore.
Gli espianti di tessuto sono simili nel concetto alle fette di tessuto e possono anche essere utilizzati per determinare la tossicità delle sostanze chimiche in specifici organi bersaglio. Gli espianti di tessuto vengono stabiliti rimuovendo un piccolo frammento di tessuto (per gli studi di teratogenicità, un embrione intatto) e ponendolo in coltura per ulteriori studi. Le colture di espianti sono state utili per studi di tossicità a breve termine, tra cui irritazione e corrosività nella pelle, studi sull'amianto nella trachea e studi di neurotossicità nel tessuto cerebrale.
Gli organi perfusi isolati possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità dell'organo bersaglio. Questi sistemi offrono un vantaggio simile a quello delle fette di tessuto e degli espianti in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule, ma senza lo stress al tessuto introdotto dalle manipolazioni coinvolte nella preparazione delle fette. Inoltre, consentono il mantenimento delle interazioni intra-organo. Uno dei principali svantaggi è la loro fattibilità a breve termine, che ne limita l'uso per i test di tossicità in vitro. In termini di servizio come alternativa, queste colture possono essere considerate un perfezionamento poiché gli animali non subiscono le conseguenze negative del trattamento in vivo con sostanze tossiche. Tuttavia, il loro uso non riduce significativamente il numero di animali richiesti.
In sintesi, sono disponibili diversi tipi di sistemi in vitro per valutare la tossicità degli organi bersaglio. È possibile acquisire molte informazioni sui meccanismi di tossicità utilizzando una o più di queste tecniche. La difficoltà rimane nel saper estrapolare da un sistema in vitro, che rappresenta una parte relativamente piccola del processo tossicologico, all'intero processo che avviene in vivo.
Test in vitro per l'irritazione oculare
Forse il test di tossicità su animali interi più controverso dal punto di vista del benessere degli animali è il test di Draize per l'irritazione oculare, condotto sui conigli. In questo test, una piccola dose fissa di una sostanza chimica viene posta in uno degli occhi del coniglio mentre l'altro occhio viene utilizzato come controllo. Il grado di irritazione e infiammazione viene misurato in vari momenti dopo l'esposizione. Si sta facendo un grande sforzo per sviluppare metodologie per sostituire questo test, che è stato criticato non solo per ragioni umane, ma anche per la soggettività delle osservazioni e la variabilità dei risultati. È interessante notare che, nonostante le dure critiche che il test di Draize ha ricevuto, ha dimostrato di avere un notevole successo nel predire gli irritanti per l'occhio umano, in particolare le sostanze leggermente o moderatamente irritanti, che sono difficili da identificare con altri metodi. Pertanto, le richieste di alternative in vitro sono elevate.
La ricerca di alternative al test di Draize è complicata, anche se si prevede che avrà successo. Sono state sviluppate numerose alternative in vitro e di altro tipo e in alcuni casi sono state implementate. Le alternative di raffinamento al test di Draize, che per definizione sono meno dolorose o angoscianti per gli animali, includono il Low Volume Eye Test, in cui piccole quantità di materiali di prova vengono poste negli occhi dei conigli, non solo per ragioni umane, ma per imitare più da vicino le quantità a cui le persone possono essere effettivamente esposte accidentalmente. Un altro perfezionamento è che le sostanze che hanno un pH inferiore a 2 o superiore a 11.5 non vengono più testate sugli animali poiché sono note per essere gravemente irritanti per gli occhi.
Tra il 1980 e il 1989, è stato stimato un calo dell'87% nel numero di conigli utilizzati per i test di irritazione oculare dei cosmetici. I test in vitro sono stati incorporati come parte di un approccio di test di livello per realizzare questa vasta riduzione dei test su animali interi. Questo approccio è un processo in più fasi che inizia con un esame approfondito dei dati storici sull'irritazione oculare e l'analisi fisica e chimica della sostanza chimica da valutare. Se questi due processi non forniscono informazioni sufficienti, viene eseguita una batteria di test in vitro. I dati aggiuntivi ottenuti dai test in vitro potrebbero quindi essere sufficienti per valutare la sicurezza della sostanza. In caso contrario, il passaggio finale consisterebbe nell'eseguire test in vivo limitati. È facile vedere come questo approccio possa eliminare o almeno ridurre drasticamente il numero di animali necessari per prevedere la sicurezza di una sostanza sperimentale.
La batteria di test in vitro utilizzata come parte di questa strategia di test di livello dipende dalle esigenze del settore specifico. I test di irritazione oculare vengono eseguiti da un'ampia varietà di industrie, dai cosmetici ai prodotti farmaceutici ai prodotti chimici industriali. Il tipo di informazioni richieste da ciascun settore varia e pertanto non è possibile definire un'unica batteria di test in vitro. Una batteria di test è generalmente progettata per valutare cinque parametri: citotossicità, cambiamenti nella fisiologia e biochimica dei tessuti, relazioni quantitative struttura-attività, mediatori dell'infiammazione e recupero e riparazione. Un esempio di test per la citotossicità, che è una possibile causa di irritazione, è il test del rosso neutro che utilizza cellule in coltura (vedi sopra). I cambiamenti nella fisiologia cellulare e nella biochimica risultanti dall'esposizione a una sostanza chimica possono essere analizzati in colture di cellule epiteliali corneali umane. In alternativa, gli investigatori hanno utilizzato anche bulbi oculari di bovini o di pollo intatti o sezionati ottenuti dai macelli. Molti degli endpoint misurati in queste colture di organi interi sono gli stessi di quelli misurati in vivo, come l'opacità corneale e il gonfiore corneale.
L'infiammazione è spesso una componente della lesione oculare indotta da sostanze chimiche e sono disponibili numerosi test per esaminare questo parametro. Vari saggi biochimici rilevano la presenza di mediatori rilasciati durante il processo infiammatorio come l'acido arachidonico e le citochine. Anche la membrana corioallantoidea (CAM) dell'uovo di gallina può essere utilizzata come indicatore di infiammazione. Nel saggio CAM, un piccolo pezzo del guscio di un embrione di pulcino da dieci a 14 giorni viene rimosso per esporre il CAM. La sostanza chimica viene quindi applicata alla CAM e i segni di infiammazione, come l'emorragia vascolare, vengono segnati in vari momenti successivi.
Uno dei processi in vivo più difficili da valutare in vitro è il recupero e la riparazione del danno oculare. Uno strumento di nuova concezione, il microfisiometro al silicio, misura piccoli cambiamenti nel pH extracellulare e può essere utilizzato per monitorare le cellule in coltura in tempo reale. Questa analisi ha dimostrato di correlare abbastanza bene con il recupero in vivo ed è stata utilizzata come test in vitro per questo processo. Questa è stata una breve panoramica dei tipi di test utilizzati come alternative al test di Draize per l'irritazione oculare. È probabile che nei prossimi anni venga definita una serie completa di batterie di test in vitro e ciascuna sarà convalidata per il suo scopo specifico.
Convalida
La chiave per l'accettazione normativa e l'implementazione delle metodologie di test in vitro è la convalida, il processo mediante il quale viene stabilita la credibilità di un test candidato per uno scopo specifico. Gli sforzi per definire e coordinare il processo di convalida sono stati compiuti sia negli Stati Uniti che in Europa. L'Unione Europea ha istituito il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) nel 1993 per coordinare gli sforzi e per interagire con organizzazioni americane come il Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centro accademico negli Stati Uniti e il Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida di metodi alternativi (ICCVAM), composto da rappresentanti del National Institutes of Health, dell'Agenzia statunitense per la protezione dell'ambiente, della Food and Drug Administration statunitense e della Commissione per la sicurezza dei prodotti di consumo.
La convalida dei test in vitro richiede un'organizzazione e una pianificazione sostanziali. Deve esserci consenso tra le autorità di regolamentazione del governo e gli scienziati industriali e accademici su procedure accettabili e una supervisione sufficiente da parte di un comitato consultivo scientifico per garantire che i protocolli soddisfino gli standard stabiliti. Gli studi di convalida dovrebbero essere eseguiti in una serie di laboratori di riferimento utilizzando serie calibrate di sostanze chimiche provenienti da una banca chimica e cellule o tessuti provenienti da un'unica fonte. Sia la ripetibilità intralaboratorio che la riproducibilità interlaboratorio di una prova candidata devono essere dimostrate ei risultati devono essere sottoposti ad un'analisi statistica appropriata. Una volta raccolti i risultati delle diverse componenti degli studi di convalida, il comitato consultivo scientifico può formulare raccomandazioni sulla validità del/i test candidato/i per uno scopo specifico. Inoltre, i risultati degli studi dovrebbero essere pubblicati su riviste peer-reviewed e inseriti in un database.
La definizione del processo di validazione è attualmente un work in progress. Ogni nuovo studio di validazione fornirà informazioni utili alla progettazione dello studio successivo. La comunicazione e la cooperazione internazionale sono essenziali per il rapido sviluppo di una serie di protocolli ampiamente accettabili, in particolare data la maggiore urgenza imposta dall'approvazione della direttiva CE sui cosmetici. Questa legislazione può effettivamente fornire lo slancio necessario per intraprendere un serio sforzo di convalida. È solo attraverso il completamento di questo processo che può iniziare l'accettazione dei metodi in vitro da parte delle varie comunità di regolamentazione.
Conclusione
Questo articolo ha fornito un'ampia panoramica dello stato attuale dei test di tossicità in vitro. La scienza della tossicologia in vitro è relativamente giovane, ma sta crescendo in modo esponenziale. La sfida per gli anni a venire è incorporare la conoscenza meccanicistica generata dagli studi cellulari e molecolari nel vasto inventario di dati in vivo per fornire una descrizione più completa dei meccanismi tossicologici e stabilire un paradigma con cui i dati in vitro possono essere utilizzati prevedere la tossicità in vivo. Sarà solo attraverso gli sforzi concertati dei tossicologi e dei rappresentanti del governo che si potrà realizzare il valore intrinseco di questi metodi in vitro.
L'analisi delle relazioni struttura-attività (SAR) è l'utilizzo di informazioni sulla struttura molecolare delle sostanze chimiche per prevedere caratteristiche importanti relative a persistenza, distribuzione, assorbimento e assorbimento e tossicità. Il SAR è un metodo alternativo per identificare potenziali sostanze chimiche pericolose, che promette di assistere le industrie e i governi nella definizione delle priorità delle sostanze per un'ulteriore valutazione o per il processo decisionale in fase iniziale per nuove sostanze chimiche. La tossicologia è un'impresa sempre più costosa e ad alta intensità di risorse. Le crescenti preoccupazioni sulla possibilità che le sostanze chimiche causino effetti avversi nelle popolazioni umane esposte hanno spinto le agenzie di regolamentazione e sanitarie ad ampliare la gamma e la sensibilità dei test per rilevare i rischi tossicologici. Allo stesso tempo, gli oneri reali e percepiti della regolamentazione sull'industria hanno provocato preoccupazioni per la praticità dei metodi di test della tossicità e dell'analisi dei dati. Allo stato attuale, la determinazione della cancerogenicità chimica dipende dai test a vita di almeno due specie, entrambi i sessi, a diverse dosi, con un'attenta analisi istopatologica di più organi, nonché dal rilevamento di alterazioni preneoplastiche nelle cellule e negli organi bersaglio. Negli Stati Uniti, si stima che il test biologico del cancro abbia un costo superiore a 3 milioni di dollari (dollari del 1995).
Anche con risorse finanziarie illimitate, l'onere di testare le circa 70,000 sostanze chimiche esistenti prodotte oggi nel mondo supererebbe le risorse disponibili di tossicologi qualificati. Sarebbero necessari secoli per completare anche una valutazione di primo livello di queste sostanze chimiche (NRC 1984). In molti paesi sono aumentate le preoccupazioni etiche sull'uso di animali nei test di tossicità, portando ulteriori pressioni sull'uso di metodi standard di test di tossicità. Il SAR è stato ampiamente utilizzato nell'industria farmaceutica per identificare molecole potenzialmente utili per il trattamento (Hansch e Zhang 1993). Nella politica di salute ambientale e occupazionale, il SAR viene utilizzato per prevedere la dispersione di composti nell'ambiente chimico-fisico e per selezionare nuove sostanze chimiche per un'ulteriore valutazione della potenziale tossicità. Ai sensi del Toxic Substances Control Act (TSCA) degli Stati Uniti, l'EPA ha utilizzato dal 1979 un approccio SAR come "primo screening" di nuove sostanze chimiche nel processo di notifica prefabbricazione (PMN); L'Australia utilizza un approccio simile come parte della sua nuova procedura di notifica delle sostanze chimiche (NICNAS). Negli Stati Uniti l'analisi SAR è una base importante per determinare che esiste una base ragionevole per concludere che la fabbricazione, la lavorazione, la distribuzione, l'uso o lo smaltimento della sostanza presenteranno un rischio irragionevole di danno per la salute umana o per l'ambiente, come richiesto dalla Sezione 5(f) del TSCA. Sulla base di questa constatazione, l'EPA può quindi richiedere test effettivi della sostanza ai sensi della sezione 6 del TSCA.
Razionale per SAR
Il razionale scientifico per SAR si basa sul presupposto che la struttura molecolare di una sostanza chimica predice aspetti importanti del suo comportamento nei sistemi fisico-chimici e biologici (Hansch e Leo 1979).
Processo SAR
Il processo di revisione SAR include l'identificazione della struttura chimica, comprese le formulazioni empiriche e il composto puro; identificazione di sostanze strutturalmente analoghe; ricerca in banche dati e letteratura per informazioni su analoghi strutturali; e analisi della tossicità e altri dati sugli analoghi strutturali. In alcuni rari casi, le informazioni sulla struttura del composto da sole possono essere sufficienti per supportare alcune analisi SAR, basate su meccanismi di tossicità ben noti. Sono stati compilati diversi database su SAR, nonché metodi basati su computer per la previsione della struttura molecolare.
Con queste informazioni, i seguenti endpoint possono essere stimati con SAR:
Va notato che non esistono metodi SAR per endpoint sanitari così importanti come cancerogenicità, tossicità per lo sviluppo, tossicità riproduttiva, neurotossicità, immunotossicità o altri effetti sugli organi bersaglio. Ciò è dovuto a tre fattori: la mancanza di un ampio database su cui testare le ipotesi SAR, la mancanza di conoscenza dei determinanti strutturali dell'azione tossica e la molteplicità delle cellule bersaglio e dei meccanismi coinvolti in questi endpoint (vedere "The United States approccio alla valutazione del rischio di sostanze tossiche per la riproduzione e agenti neurotossici”). Alcuni tentativi limitati di utilizzare il SAR per prevedere la farmacocinetica utilizzando informazioni sui coefficienti di partizione e sulla solubilità (Johanson e Naslund 1988). È stato fatto un SAR quantitativo più ampio per prevedere il metabolismo P450-dipendente di una gamma di composti e il legame di molecole simili a diossina e PCB al recettore citosolico della "diossina" (Hansch e Zhang 1993).
È stato dimostrato che il SAR ha una prevedibilità variabile per alcuni degli endpoint sopra elencati, come mostrato nella tabella 1. Questa tabella presenta i dati di due confronti dell'attività prevista con i risultati effettivi ottenuti mediante misurazione empirica o test di tossicità. Il SAR condotto dagli esperti dell'EPA statunitense ha ottenuto risultati più scarsi nella previsione delle proprietà fisico-chimiche rispetto alla previsione dell'attività biologica, inclusa la biodegradazione. Per gli endpoint di tossicità, SAR ha ottenuto i risultati migliori per prevedere la mutagenicità. Anche Ashby e Tennant (1991) in uno studio più esteso hanno riscontrato una buona prevedibilità della genotossicità a breve termine nella loro analisi delle sostanze chimiche NTP. Questi risultati non sono sorprendenti, data l'attuale comprensione dei meccanismi molecolari della genotossicità (vedi "Tossicologia genetica") e il ruolo dell'elettrofilia nel legame del DNA. Al contrario, il SAR tendeva a sottostimare la tossicità sistemica e subcronica nei mammiferi ea sovrastimare la tossicità acuta per gli organismi acquatici.
Tabella 1. Confronto dei dati SAR e dei test: analisi OCSE/NTP
endpoint | Accordo (%) | Disaccordo (%) | Numero |
Punto di ebollizione | 50 | 50 | 30 |
Pressione del vapore | 63 | 37 | 113 |
Solubilità dell'acqua | 68 | 32 | 133 |
Coefficiente di ripartizione | 61 | 39 | 82 |
La biodegradazione | 93 | 7 | 107 |
Tossicità per i pesci | 77 | 22 | 130 |
Tossicità dafnie | 67 | 33 | 127 |
Tossicità acuta per i mammiferi (LD50 ) | 80 | 201 | 142 |
Irritazione della pelle | 82 | 18 | 144 |
Irritazione agli occhi | 78 | 22 | 144 |
Sensibilizzazione cutanea | 84 | 16 | 144 |
Tossicità subcronica | 57 | 32 | 143 |
Mutagenesi2 | 88 | 12 | 139 |
Mutagenesi3 | 82-944 | 1-10 | 301 |
Cancerogenicità3 : Saggio biologico di due anni | 72-954 | - | 301 |
Fonte: dati OCSE, comunicazione personale C. Auer, US EPA. In questa analisi sono stati utilizzati solo gli endpoint per i quali erano disponibili previsioni SAR comparabili e dati di test effettivi. I dati NTP provengono da Ashby e Tennant 1991.
1 Desta preoccupazione è stata l'incapacità del SAR di prevedere la tossicità acuta nel 12% delle sostanze chimiche testate.
2 Dati OCSE, basati sulla concordanza del test di Ames con SAR
3 Dati NTP, basati su test genetox rispetto alle previsioni SAR per diverse classi di "sostanze chimiche strutturalmente allerta".
4 La concordanza varia con la classe; la maggiore concordanza era con i composti aromatici ammino/nitro; più basso con strutture “varie”.
Per altri endpoint tossici, come notato sopra, SAR ha un'utilità meno dimostrabile. Le previsioni sulla tossicità nei mammiferi sono complicate dalla mancanza di SAR per la tossicocinetica di molecole complesse. Tuttavia, sono stati fatti alcuni tentativi per proporre principi SAR per endpoint complessi di tossicità sui mammiferi (per esempio, vedere Bernstein (1984) per un'analisi SAR di potenziali sostanze tossiche per la riproduzione maschile). Nella maggior parte dei casi, il database è troppo piccolo per consentire test rigorosi delle previsioni basate sulla struttura.
A questo punto si può concludere che il SAR può essere utile principalmente per dare la priorità all'investimento di risorse per i test di tossicità o per sollevare preoccupazioni in merito a potenziali pericoli. Solo nel caso della mutagenicità è probabile che l'analisi SAR da sola possa essere utilizzata con affidabilità per informare altre decisioni. Per nessun endpoint è probabile che SAR possa fornire il tipo di informazioni quantitative richieste ai fini della valutazione del rischio come discusso altrove in questo capitolo e Enciclopedia.
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