Domenica, Gennaio 16 2011 18: 53

Test di tossicità in vitro

Vota questo gioco
(3 voti )

L'emergere di sofisticate tecnologie nella biologia molecolare e cellulare ha stimolato un'evoluzione relativamente rapida nelle scienze della vita, compresa la tossicologia. In effetti, l'attenzione della tossicologia si sta spostando da interi animali e popolazioni di interi animali alle cellule e alle molecole di singoli animali e umani. Dalla metà degli anni '1980, i tossicologi hanno iniziato a impiegare queste nuove metodologie per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui sistemi viventi. Come logica progressione, tali metodi vengono adattati ai fini dei test di tossicità. Questi progressi scientifici hanno collaborato con fattori sociali ed economici per modificare la valutazione della sicurezza del prodotto e del rischio potenziale.

I fattori economici sono specificamente legati al volume dei materiali che devono essere testati. Ogni anno viene introdotta sul mercato una miriade di nuovi cosmetici, prodotti farmaceutici, pesticidi, prodotti chimici e prodotti per la casa. Tutti questi prodotti devono essere valutati per la loro potenziale tossicità. Inoltre, vi è un arretrato di prodotti chimici già in uso che non sono stati adeguatamente testati. L'enorme compito di ottenere informazioni dettagliate sulla sicurezza di tutte queste sostanze chimiche utilizzando i tradizionali metodi di sperimentazione su animali interi sarebbe costoso in termini sia di denaro che di tempo, se potesse essere portato a termine.

Esistono anche questioni sociali che riguardano la salute e la sicurezza pubblica, nonché una crescente preoccupazione del pubblico sull'uso di animali per i test sulla sicurezza dei prodotti. Per quanto riguarda la sicurezza umana, l'interesse pubblico e i gruppi di difesa dell'ambiente hanno esercitato pressioni significative sulle agenzie governative affinché applicassero normative più rigorose sulle sostanze chimiche. Un recente esempio di ciò è stato un movimento di alcuni gruppi ambientalisti per vietare il cloro e i composti contenenti cloro negli Stati Uniti. Una delle motivazioni di un'azione così estrema risiede nel fatto che la maggior parte di questi composti non è mai stata adeguatamente testata. Dal punto di vista tossicologico, il concetto di vietare un'intera classe di sostanze chimiche diverse basato semplicemente sulla presenza di cloro è sia scientificamente infondato che irresponsabile. Tuttavia, è comprensibile che, dal punto di vista del pubblico, ci debba essere una certa garanzia che le sostanze chimiche rilasciate nell'ambiente non comportino un rischio significativo per la salute. Tale situazione sottolinea la necessità di metodi più efficienti e rapidi per valutare la tossicità.

L'altra preoccupazione della società che ha avuto un impatto sull'area dei test di tossicità è il benessere degli animali. Il numero crescente di gruppi per la protezione degli animali in tutto il mondo ha espresso una notevole opposizione all'uso di animali interi per i test sulla sicurezza dei prodotti. Sono state condotte campagne attive contro i produttori di cosmetici, prodotti per la cura della casa e della persona e prodotti farmaceutici nel tentativo di fermare i test sugli animali. Tali sforzi in Europa hanno portato all'approvazione del sesto emendamento alla direttiva 76/768/CEE (la direttiva sui cosmetici). La conseguenza di questa direttiva è che i prodotti cosmetici o gli ingredienti cosmetici che sono stati testati sugli animali dopo il 1° gennaio 1998 non possono essere commercializzati nell'Unione Europea, a meno che metodi alternativi non siano sufficientemente convalidati. Sebbene questa direttiva non abbia giurisdizione sulla vendita di tali prodotti negli Stati Uniti o in altri paesi, influirà in modo significativo sulle società che hanno mercati internazionali che includono l'Europa.

Il concetto di alternative, che costituisce la base per lo sviluppo di test diversi da quelli su animali interi, è definito dai tre Rs: riduzione nel numero di animali utilizzati; raffinatezza di protocolli in modo che gli animali provino meno stress o disagio; e sostituzione degli attuali test sugli animali con test in vitro (cioè test eseguiti al di fuori dell'animale vivente), modelli computerizzati o test su specie di vertebrati o invertebrati inferiori. I tre Rs sono stati introdotti in un libro pubblicato nel 1959 da due scienziati britannici, WMS Russell e Rex Burch, I principi della tecnica sperimentale umana. Russell e Burch sostenevano che l'unico modo per ottenere risultati scientifici validi fosse attraverso il trattamento umano degli animali e ritenevano che si dovessero sviluppare metodi per ridurre l'uso di animali e alla fine sostituirlo. È interessante notare che i principi delineati da Russell e Burch hanno ricevuto poca attenzione fino alla rinascita del movimento per il benessere degli animali a metà degli anni '1970. Oggi il concetto dei tre Rs è all'avanguardia per quanto riguarda la ricerca, i test e l'istruzione.

In sintesi, lo sviluppo delle metodologie di test in vitro è stato influenzato da una varietà di fattori che sono confluiti negli ultimi dieci o vent'anni. È difficile accertare se qualcuno di questi fattori da solo avrebbe avuto un effetto così profondo sulle strategie dei test di tossicità.

Concetto di test di tossicità in vitro

Questa sezione si concentrerà esclusivamente sui metodi in vitro per valutare la tossicità, come una delle alternative alla sperimentazione su animali interi. Ulteriori alternative non animali come la modellazione al computer e le relazioni quantitative struttura-attività sono discusse in altri articoli di questo capitolo.

Gli studi in vitro sono generalmente condotti su cellule o tessuti animali o umani al di fuori del corpo. In vitro significa letteralmente "in vetro" e si riferisce a procedure eseguite su materiale vivo o componenti di materiale vivo coltivate in capsule di Petri o in provette in condizioni definite. Questi possono essere messi a confronto con gli studi in vivo, o con quelli effettuati “nell'animale vivente”. Sebbene sia difficile, se non impossibile, proiettare gli effetti di una sostanza chimica su un organismo complesso quando le osservazioni sono limitate a un singolo tipo di cellule in una piastra, gli studi in vitro forniscono anche una quantità significativa di informazioni sulla tossicità intrinseca. come meccanismi cellulari e molecolari di tossicità. Inoltre, offrono molti vantaggi rispetto agli studi in vivo in quanto sono generalmente meno costosi e possono essere condotti in condizioni più controllate. Inoltre, nonostante il fatto che sia ancora necessario un piccolo numero di animali per ottenere cellule per colture in vitro, questi metodi possono essere considerati alternative di riduzione (poiché vengono utilizzati molti meno animali rispetto agli studi in vivo) e alternative di raffinamento (perché eliminano la necessità sottoporre gli animali alle conseguenze tossiche avverse imposte dagli esperimenti in vivo).

Per interpretare i risultati dei test di tossicità in vitro, determinarne la potenziale utilità nella valutazione della tossicità e metterli in relazione con il processo tossicologico complessivo in vivo, è necessario comprendere quale parte del processo tossicologico si sta esaminando. L'intero processo tossicologico è costituito da eventi che iniziano con l'esposizione dell'organismo a un agente fisico o chimico, progrediscono attraverso interazioni cellulari e molecolari e si manifestano infine nella risposta dell'intero organismo. I test in vitro sono generalmente limitati alla parte del processo tossicologico che avviene a livello cellulare e molecolare. I tipi di informazioni che possono essere ottenuti dagli studi in vitro includono le vie del metabolismo, l'interazione dei metaboliti attivi con i bersagli cellulari e molecolari e gli endpoint tossici potenzialmente misurabili che possono fungere da biomarcatori molecolari per l'esposizione. In una situazione ideale, sarebbe noto il meccanismo di tossicità di ciascuna sostanza chimica dall'esposizione alla manifestazione dell'organismo, in modo tale che le informazioni ottenute dai test in vitro possano essere completamente interpretate e correlate alla risposta dell'intero organismo. Tuttavia, questo è praticamente impossibile, poiché sono stati chiariti relativamente pochi meccanismi tossicologici completi. Pertanto, i tossicologi si trovano di fronte a una situazione in cui i risultati di un test in vitro non possono essere utilizzati come previsione del tutto accurata della tossicità in vivo perché il meccanismo è sconosciuto. Tuttavia, spesso durante il processo di sviluppo di un test in vitro, vengono chiariti i componenti dei meccanismi cellulari e molecolari della tossicità.

Una delle principali questioni irrisolte che circondano lo sviluppo e l'implementazione dei test in vitro è legata alla seguente considerazione: dovrebbero essere basati meccanicamente o è sufficiente che siano descrittivi? È indiscutibilmente meglio da un punto di vista scientifico utilizzare solo test meccanicistici come sostituti dei test in vivo. Tuttavia, in assenza di una conoscenza meccanicistica completa, la prospettiva di sviluppare test in vitro per sostituire completamente i test su animali interi nel prossimo futuro è quasi nulla. Ciò, tuttavia, non esclude l'uso di tipi di test più descrittivi come strumenti di screening precoce, come avviene attualmente. Questi schermi hanno portato a una significativa riduzione dell'uso di animali. Pertanto, fino a quando non verranno generate più informazioni meccanicistiche, potrebbe essere necessario impiegare in misura più limitata test i cui risultati si correlano semplicemente bene con quelli ottenuti in vivo.

Test in vitro per la citotossicità

In questa sezione verranno descritti diversi test in vitro che sono stati sviluppati per valutare il potenziale citotossico di una sostanza chimica. Per la maggior parte, questi test sono facili da eseguire e l'analisi può essere automatizzata. Un test in vitro comunemente usato per la citotossicità è il test del rosso neutro. Questo test viene eseguito su cellule in coltura e, per la maggior parte delle applicazioni, le cellule possono essere mantenute in piastre di coltura che contengono 96 piccoli pozzetti, ciascuno di 6.4 mm di diametro. Poiché ciascun pozzetto può essere utilizzato per una singola determinazione, questa disposizione può contenere più concentrazioni della sostanza chimica in esame nonché controlli positivi e negativi con un numero sufficiente di repliche per ciascuno. Dopo il trattamento delle cellule con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame comprese in almeno due ordini di grandezza (ad esempio, da 0.01 mM a 1 mM), nonché sostanze chimiche di controllo positive e negative, le cellule vengono risciacquate e trattate con rosso neutro, un colorante che può essere assorbito e trattenuto solo dalle cellule vive. Il colorante può essere aggiunto alla rimozione della sostanza chimica in esame per determinare gli effetti immediati, oppure può essere aggiunto in momenti diversi dopo la rimozione della sostanza chimica in esame per determinare effetti cumulativi o ritardati. L'intensità del colore in ogni pozzetto corrisponde al numero di cellule vive in quel pozzetto. L'intensità del colore è misurata da uno spettrofotometro che può essere dotato di un lettore di lastre. Il lettore di piastre è programmato per fornire misurazioni individuali per ciascuno dei 96 pozzetti della piastra di coltura. Questa metodologia automatizzata consente allo sperimentatore di eseguire rapidamente un esperimento concentrazione-risposta e di ottenere dati statisticamente utili.

Un altro test relativamente semplice per la citotossicità è il test MTT. MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro) è un colorante tetrazolio che viene ridotto dagli enzimi mitocondriali a un colore blu. Solo le cellule con mitocondri vitali manterranno la capacità di eseguire questa reazione; pertanto l'intensità del colore è direttamente correlata al grado di integrità mitocondriale. Questo è un test utile per rilevare composti citotossici generali così come quegli agenti che prendono di mira specificamente i mitocondri.

La misurazione dell'attività della lattato deidrogenasi (LDH) viene utilizzata anche come test ad ampio raggio per la citotossicità. Questo enzima è normalmente presente nel citoplasma delle cellule viventi e viene rilasciato nel mezzo di coltura cellulare attraverso membrane cellulari che perdono di cellule morte o morenti che sono state influenzate negativamente da un agente tossico. Piccole quantità di terreno di coltura possono essere rimosse in vari momenti dopo il trattamento chimico delle cellule per misurare la quantità di LDH rilasciata e determinare un andamento temporale della tossicità. Sebbene il test di rilascio di LDH sia una valutazione molto generale della citotossicità, è utile perché è facile da eseguire e può essere eseguito in tempo reale.

Ci sono molti nuovi metodi in fase di sviluppo per rilevare il danno cellulare. Metodi più sofisticati impiegano sonde fluorescenti per misurare una varietà di parametri intracellulari, come il rilascio di calcio e le variazioni del pH e del potenziale di membrana. In generale, queste sonde sono molto sensibili e possono rilevare cambiamenti cellulari più sottili, riducendo così la necessità di utilizzare la morte cellulare come endpoint. Inoltre, molti di questi saggi fluorescenti possono essere automatizzati mediante l'uso di piastre a 96 pozzetti e lettori di piastre fluorescenti.

Una volta raccolti i dati su una serie di sostanze chimiche utilizzando uno di questi test, è possibile determinare le relative tossicità. La tossicità relativa di una sostanza chimica, determinata in un test in vitro, può essere espressa come la concentrazione che esercita un effetto del 50% sulla risposta finale delle cellule non trattate. Questa determinazione è indicata come CE50 (Effective Cconcentrazione per 50% delle cellule) e può essere utilizzato per confrontare le tossicità di diverse sostanze chimiche in vitro. (Un termine simile utilizzato per valutare la tossicità relativa è IC50, che indica la concentrazione di una sostanza chimica che provoca un'inibizione del 50% di un processo cellulare, ad esempio la capacità di assorbire il rosso neutro.) Non è facile valutare se la relativa tossicità in vitro delle sostanze chimiche sia paragonabile alla loro relativa tossicità in vivo, poiché ci sono così tanti fattori di confusione nel sistema in vivo, come la tossicocinetica, il metabolismo, i meccanismi di riparazione e difesa. Inoltre, poiché la maggior parte di questi test misura gli endpoint generali di citotossicità, non sono basati meccanicamente. Pertanto, l'accordo tra tossicità relative in vitro e in vivo è semplicemente correlativo. Nonostante le numerose complessità e difficoltà di estrapolazione da in vitro a in vivo, questi test in vitro si stanno rivelando molto preziosi perché sono semplici e poco costosi da eseguire e possono essere utilizzati come screening per segnalare farmaci o sostanze chimiche altamente tossiche nelle prime fasi di sviluppo.

Tossicità per gli organi bersaglio

I test in vitro possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità specifica per organi bersaglio. Ci sono una serie di difficoltà associate alla progettazione di tali test, la più notevole è l'incapacità dei sistemi in vitro di mantenere molte delle caratteristiche dell'organo in vivo. Spesso, quando le cellule vengono prelevate da animali e poste in coltura, tendono a degenerare rapidamente e/oa dedifferenziarsi, cioè a perdere le loro funzioni organiche ea diventare più generiche. Ciò presenta un problema in quanto entro un breve periodo di tempo, di solito pochi giorni, le colture non sono più utili per valutare gli effetti organo-specifici di una tossina.

Molti di questi problemi vengono superati grazie ai recenti progressi nella biologia molecolare e cellulare. Le informazioni ottenute sull'ambiente cellulare in vivo possono essere utilizzate nella modulazione delle condizioni di coltura in vitro. Dalla metà degli anni '1980 sono stati scoperti nuovi fattori di crescita e citochine, e molti di questi sono ora disponibili in commercio. L'aggiunta di questi fattori alle cellule in coltura aiuta a preservarne l'integrità e può anche aiutare a mantenere funzioni più differenziate per periodi di tempo più lunghi. Altri studi di base hanno accresciuto la conoscenza dei fabbisogni nutrizionali e ormonali delle cellule in coltura, così da poter formulare nuovi terreni. Sono stati compiuti recenti progressi anche nell'identificazione di matrici extracellulari sia naturali che artificiali su cui le cellule possono essere coltivate. La coltura di cellule su queste diverse matrici può avere effetti profondi sia sulla loro struttura che sulla loro funzione. Un grande vantaggio derivato da questa conoscenza è la capacità di controllare in modo complesso l'ambiente delle cellule in coltura ed esaminare individualmente gli effetti di questi fattori sui processi cellulari di base e sulle loro risposte a diversi agenti chimici. In breve, questi sistemi possono fornire una visione approfondita dei meccanismi di tossicità specifici degli organi.

Molti studi sulla tossicità degli organi bersaglio sono condotti su cellule primarie, che per definizione sono appena isolate da un organo e di solito mostrano una durata limitata in coltura. Ci sono molti vantaggi nell'avere colture primarie di un singolo tipo cellulare da un organo per la valutazione della tossicità. Da una prospettiva meccanicistica, tali colture sono utili per studiare specifici bersagli cellulari di una sostanza chimica. In alcuni casi, due o più tipi di cellule di un organo possono essere coltivati ​​insieme, e questo fornisce un ulteriore vantaggio di poter osservare le interazioni cellula-cellula in risposta a una tossina. Alcuni sistemi di co-coltura per la pelle sono stati progettati in modo da formare una struttura tridimensionale simile alla pelle in vivo. È anche possibile co-coltivare cellule di organi diversi, ad esempio fegato e reni. Questo tipo di coltura sarebbe utile per valutare gli effetti specifici sulle cellule renali, di una sostanza chimica che deve essere bioattivata nel fegato.

Anche gli strumenti biologici molecolari hanno svolto un ruolo importante nello sviluppo di linee cellulari continue che possono essere utili per i test di tossicità degli organi bersaglio. Queste linee cellulari sono generate trasfettando il DNA in cellule primarie. Nella procedura di trasfezione, le cellule e il DNA vengono trattati in modo tale che il DNA possa essere assorbito dalle cellule. Il DNA di solito proviene da un virus e contiene uno o più geni che, quando espressi, consentono alle cellule di diventare immortali (cioè in grado di vivere e crescere per lunghi periodi di tempo in coltura). Il DNA può anche essere ingegnerizzato in modo che il gene immortalizzante sia controllato da un promotore inducibile. Il vantaggio di questo tipo di costrutto è che le cellule si dividono solo quando ricevono lo stimolo chimico appropriato per consentire l'espressione del gene immortalizzante. Un esempio di tale costrutto è il grande gene dell'antigene T del Simian Virus 40 (SV40) (il gene immortalizzante), preceduto dalla regione del promotore del gene della metallotioneina, che è indotto dalla presenza di un metallo nel mezzo di coltura. Pertanto, dopo che il gene è stato trasfettato nelle cellule, le cellule possono essere trattate con basse concentrazioni di zinco per stimolare il promotore MT e attivare l'espressione del gene dell'antigene T. In queste condizioni, le cellule proliferano. Quando lo zinco viene rimosso dal mezzo, le cellule smettono di dividersi e in condizioni ideali ritornano a uno stato in cui esprimono le loro funzioni tessuto-specifiche.

La capacità di generare cellule immortalizzate combinata con i progressi nella tecnologia delle colture cellulari ha contribuito notevolmente alla creazione di linee cellulari da molti organi diversi, tra cui cervello, reni e fegato. Tuttavia, prima che queste linee cellulari possano essere utilizzate come surrogato per i tipi di cellule in buona fede, devono essere caratterizzate attentamente per determinare quanto siano realmente "normali".

Altri sistemi in vitro per lo studio della tossicità degli organi bersaglio comportano una crescente complessità. Man mano che i sistemi in vitro progrediscono in complessità dalla singola cellula alla coltura dell'intero organo, diventano più paragonabili all'ambiente in vivo, ma allo stesso tempo diventano molto più difficili da controllare dato l'aumento del numero di variabili. Pertanto, ciò che può essere guadagnato nel passaggio a un livello superiore di organizzazione può essere perso nell'incapacità del ricercatore di controllare l'ambiente sperimentale. La tabella 1 confronta alcune delle caratteristiche di vari sistemi in vitro che sono stati utilizzati per studiare l'epatotossicità.

Tabella 1. Confronto dei sistemi in vitro per gli studi di epatotossicità

Sistema Complessità
(livello di interazione)
Capacità di mantenere le funzioni specifiche del fegato Durata potenziale della cultura Capacità di controllare l'ambiente
Linee cellulari immortalizzate da cella a cella (varia con la linea cellulare) da scarso a buono (varia con la linea cellulare) indefinito eccellente
Colture primarie di epatociti cellula a cellula da discreto a eccellente (varia a seconda delle condizioni colturali) giorni a settimane eccellente
Co-colture di cellule epatiche da cella a cella (tra lo stesso tipo di cella e diversi) da buono a fantastico settimana eccellente
Fettine di fegato da cella a cella (tra tutti i tipi di cella) da buono a fantastico ore to giorni buono
Fegato isolato e perfuso da cellula a cellula (tra tutti i tipi di cellule) e intra-organo eccellente ore fiera

 

Le fette di tessuto tagliate con precisione vengono utilizzate più ampiamente per gli studi tossicologici. Sono disponibili nuovi strumenti che consentono al ricercatore di tagliare fette di tessuto uniforme in un ambiente sterile. Le fette di tessuto offrono qualche vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule dell'organo e mantengono la loro architettura in vivo e la comunicazione intercellulare. Pertanto, possono essere condotti studi in vitro per determinare il tipo di cellula bersaglio all'interno di un organo nonché per studiare la tossicità specifica dell'organo bersaglio. Uno svantaggio delle fettine è che degenerano rapidamente dopo le prime 24 ore di coltura, principalmente a causa della scarsa diffusione dell'ossigeno alle cellule all'interno delle fettine. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che è possibile ottenere un'aerazione più efficiente mediante una leggera rotazione. Questo, insieme all'uso di un mezzo più complesso, consente alle fette di sopravvivere fino a 96 ore.

Gli espianti di tessuto sono simili nel concetto alle fette di tessuto e possono anche essere utilizzati per determinare la tossicità delle sostanze chimiche in specifici organi bersaglio. Gli espianti di tessuto vengono stabiliti rimuovendo un piccolo frammento di tessuto (per gli studi di teratogenicità, un embrione intatto) e ponendolo in coltura per ulteriori studi. Le colture di espianti sono state utili per studi di tossicità a breve termine, tra cui irritazione e corrosività nella pelle, studi sull'amianto nella trachea e studi di neurotossicità nel tessuto cerebrale.

Gli organi perfusi isolati possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità dell'organo bersaglio. Questi sistemi offrono un vantaggio simile a quello delle fette di tessuto e degli espianti in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule, ma senza lo stress al tessuto introdotto dalle manipolazioni coinvolte nella preparazione delle fette. Inoltre, consentono il mantenimento delle interazioni intra-organo. Uno dei principali svantaggi è la loro fattibilità a breve termine, che ne limita l'uso per i test di tossicità in vitro. In termini di servizio come alternativa, queste colture possono essere considerate un perfezionamento poiché gli animali non subiscono le conseguenze negative del trattamento in vivo con sostanze tossiche. Tuttavia, il loro uso non riduce significativamente il numero di animali richiesti.

In sintesi, sono disponibili diversi tipi di sistemi in vitro per valutare la tossicità degli organi bersaglio. È possibile acquisire molte informazioni sui meccanismi di tossicità utilizzando una o più di queste tecniche. La difficoltà rimane nel saper estrapolare da un sistema in vitro, che rappresenta una parte relativamente piccola del processo tossicologico, all'intero processo che avviene in vivo.

Test in vitro per l'irritazione oculare

Forse il test di tossicità su animali interi più controverso dal punto di vista del benessere degli animali è il test di Draize per l'irritazione oculare, condotto sui conigli. In questo test, una piccola dose fissa di una sostanza chimica viene posta in uno degli occhi del coniglio mentre l'altro occhio viene utilizzato come controllo. Il grado di irritazione e infiammazione viene misurato in vari momenti dopo l'esposizione. Si sta facendo un grande sforzo per sviluppare metodologie per sostituire questo test, che è stato criticato non solo per ragioni umane, ma anche per la soggettività delle osservazioni e la variabilità dei risultati. È interessante notare che, nonostante le dure critiche che il test di Draize ha ricevuto, ha dimostrato di avere un notevole successo nel predire gli irritanti per l'occhio umano, in particolare le sostanze leggermente o moderatamente irritanti, che sono difficili da identificare con altri metodi. Pertanto, le richieste di alternative in vitro sono elevate.

La ricerca di alternative al test di Draize è complicata, anche se si prevede che avrà successo. Sono state sviluppate numerose alternative in vitro e di altro tipo e in alcuni casi sono state implementate. Le alternative di raffinamento al test di Draize, che per definizione sono meno dolorose o angoscianti per gli animali, includono il Low Volume Eye Test, in cui piccole quantità di materiali di prova vengono poste negli occhi dei conigli, non solo per ragioni umane, ma per imitare più da vicino le quantità a cui le persone possono essere effettivamente esposte accidentalmente. Un altro perfezionamento è che le sostanze che hanno un pH inferiore a 2 o superiore a 11.5 non vengono più testate sugli animali poiché sono note per essere gravemente irritanti per gli occhi.

Tra il 1980 e il 1989, è stato stimato un calo dell'87% nel numero di conigli utilizzati per i test di irritazione oculare dei cosmetici. I test in vitro sono stati incorporati come parte di un approccio di test di livello per realizzare questa vasta riduzione dei test su animali interi. Questo approccio è un processo in più fasi che inizia con un esame approfondito dei dati storici sull'irritazione oculare e l'analisi fisica e chimica della sostanza chimica da valutare. Se questi due processi non forniscono informazioni sufficienti, viene eseguita una batteria di test in vitro. I dati aggiuntivi ottenuti dai test in vitro potrebbero quindi essere sufficienti per valutare la sicurezza della sostanza. In caso contrario, il passaggio finale consisterebbe nell'eseguire test in vivo limitati. È facile vedere come questo approccio possa eliminare o almeno ridurre drasticamente il numero di animali necessari per prevedere la sicurezza di una sostanza sperimentale.

La batteria di test in vitro utilizzata come parte di questa strategia di test di livello dipende dalle esigenze del settore specifico. I test di irritazione oculare vengono eseguiti da un'ampia varietà di industrie, dai cosmetici ai prodotti farmaceutici ai prodotti chimici industriali. Il tipo di informazioni richieste da ciascun settore varia e pertanto non è possibile definire un'unica batteria di test in vitro. Una batteria di test è generalmente progettata per valutare cinque parametri: citotossicità, cambiamenti nella fisiologia e biochimica dei tessuti, relazioni quantitative struttura-attività, mediatori dell'infiammazione e recupero e riparazione. Un esempio di test per la citotossicità, che è una possibile causa di irritazione, è il test del rosso neutro che utilizza cellule in coltura (vedi sopra). I cambiamenti nella fisiologia cellulare e nella biochimica risultanti dall'esposizione a una sostanza chimica possono essere analizzati in colture di cellule epiteliali corneali umane. In alternativa, gli investigatori hanno utilizzato anche bulbi oculari di bovini o di pollo intatti o sezionati ottenuti dai macelli. Molti degli endpoint misurati in queste colture di organi interi sono gli stessi di quelli misurati in vivo, come l'opacità corneale e il gonfiore corneale.

L'infiammazione è spesso una componente della lesione oculare indotta da sostanze chimiche e sono disponibili numerosi test per esaminare questo parametro. Vari saggi biochimici rilevano la presenza di mediatori rilasciati durante il processo infiammatorio come l'acido arachidonico e le citochine. Anche la membrana corioallantoidea (CAM) dell'uovo di gallina può essere utilizzata come indicatore di infiammazione. Nel saggio CAM, un piccolo pezzo del guscio di un embrione di pulcino da dieci a 14 giorni viene rimosso per esporre il CAM. La sostanza chimica viene quindi applicata alla CAM e i segni di infiammazione, come l'emorragia vascolare, vengono segnati in vari momenti successivi.

Uno dei processi in vivo più difficili da valutare in vitro è il recupero e la riparazione del danno oculare. Uno strumento di nuova concezione, il microfisiometro al silicio, misura piccoli cambiamenti nel pH extracellulare e può essere utilizzato per monitorare le cellule in coltura in tempo reale. Questa analisi ha dimostrato di correlare abbastanza bene con il recupero in vivo ed è stata utilizzata come test in vitro per questo processo. Questa è stata una breve panoramica dei tipi di test utilizzati come alternative al test di Draize per l'irritazione oculare. È probabile che nei prossimi anni venga definita una serie completa di batterie di test in vitro e ciascuna sarà convalidata per il suo scopo specifico.

Convalida

La chiave per l'accettazione normativa e l'implementazione delle metodologie di test in vitro è la convalida, il processo mediante il quale viene stabilita la credibilità di un test candidato per uno scopo specifico. Gli sforzi per definire e coordinare il processo di convalida sono stati compiuti sia negli Stati Uniti che in Europa. L'Unione Europea ha istituito il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) nel 1993 per coordinare gli sforzi e per interagire con organizzazioni americane come il Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centro accademico negli Stati Uniti e il Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida di metodi alternativi (ICCVAM), composto da rappresentanti del National Institutes of Health, dell'Agenzia statunitense per la protezione dell'ambiente, della Food and Drug Administration statunitense e della Commissione per la sicurezza dei prodotti di consumo.

La convalida dei test in vitro richiede un'organizzazione e una pianificazione sostanziali. Deve esserci consenso tra le autorità di regolamentazione del governo e gli scienziati industriali e accademici su procedure accettabili e una supervisione sufficiente da parte di un comitato consultivo scientifico per garantire che i protocolli soddisfino gli standard stabiliti. Gli studi di convalida dovrebbero essere eseguiti in una serie di laboratori di riferimento utilizzando serie calibrate di sostanze chimiche provenienti da una banca chimica e cellule o tessuti provenienti da un'unica fonte. Sia la ripetibilità intralaboratorio che la riproducibilità interlaboratorio di una prova candidata devono essere dimostrate ei risultati devono essere sottoposti ad un'analisi statistica appropriata. Una volta raccolti i risultati delle diverse componenti degli studi di convalida, il comitato consultivo scientifico può formulare raccomandazioni sulla validità del/i test candidato/i per uno scopo specifico. Inoltre, i risultati degli studi dovrebbero essere pubblicati su riviste peer-reviewed e inseriti in un database.

La definizione del processo di validazione è attualmente un work in progress. Ogni nuovo studio di validazione fornirà informazioni utili alla progettazione dello studio successivo. La comunicazione e la cooperazione internazionale sono essenziali per il rapido sviluppo di una serie di protocolli ampiamente accettabili, in particolare data la maggiore urgenza imposta dall'approvazione della direttiva CE sui cosmetici. Questa legislazione può effettivamente fornire lo slancio necessario per intraprendere un serio sforzo di convalida. È solo attraverso il completamento di questo processo che può iniziare l'accettazione dei metodi in vitro da parte delle varie comunità di regolamentazione.

Conclusione

Questo articolo ha fornito un'ampia panoramica dello stato attuale dei test di tossicità in vitro. La scienza della tossicologia in vitro è relativamente giovane, ma sta crescendo in modo esponenziale. La sfida per gli anni a venire è incorporare la conoscenza meccanicistica generata dagli studi cellulari e molecolari nel vasto inventario di dati in vivo per fornire una descrizione più completa dei meccanismi tossicologici e stabilire un paradigma con cui i dati in vitro possono essere utilizzati prevedere la tossicità in vivo. Sarà solo attraverso gli sforzi concertati dei tossicologi e dei rappresentanti del governo che si potrà realizzare il valore intrinseco di questi metodi in vitro.

 

Di ritorno

Leggi 11509 volte Ultima modifica il Venerdì, Settembre 23 2011 17: 07

" DISCLAIMER: L'ILO non si assume alcuna responsabilità per i contenuti presentati su questo portale Web presentati in una lingua diversa dall'inglese, che è la lingua utilizzata per la produzione iniziale e la revisione tra pari del contenuto originale. Alcune statistiche non sono state aggiornate da allora la produzione della 4a edizione dell'Enciclopedia (1998)."

Contenuti

Riferimenti tossicologici

Andersen, KE e HI Maibach. 1985. Test predittivi di allergia da contatto su cavie. Cap. 14 pollici Problemi attuali in dermatologia. Basilea: Karger.

Ashby, J e RW Tennant. 1991. Relazioni definitive tra struttura chimica, cancerogenicità e mutagenicità per 301 sostanze chimiche testate dall'NTP statunitense. Mutat Res 257: 229-306.

Barlow, S e F Sullivan. 1982. Rischi riproduttivi di prodotti chimici industriali. Londra: stampa accademica.

Barrett, JC. 1993a. Meccanismi di azione di cancerogeni umani noti. In Meccanismi di cancerogenesi nell'identificazione del rischio, a cura di H Vainio, PN Magee, DB McGregor e AJ McMichael. Lione: Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC).

—. 1993 b. Meccanismi di carcinogenesi a più fasi e valutazione del rischio cancerogeno. Ambiente Salute Persp 100: 9-20.

Bernstein, ME. 1984. Agenti che influenzano il sistema riproduttivo maschile: effetti della struttura sull'attività. Drug Metab Rev 15: 941-996.

Beutler, E. 1992. La biologia molecolare delle varianti G6PD e altri difetti dei globuli rossi. Annu Rev Med 43: 47-59.

Bloom, AD. 1981. Linee guida per gli studi sulla riproduzione nelle popolazioni umane esposte. White Plains, New York: Fondazione March of Dimes.

Borghoff, S, B Short e J Swenberg. 1990. Meccanismi biochimici e patobiologia della nefropatia a-2-globulina. Annu Rev Pharmacol Toxicol 30: 349.

Burchell, B, DW Nebert, DR Nelson, KW Bock, T Iyanagi, PLM Jansen, D Lancet, GJ Mulder, JR Chowdhury, G Siest, TR Tephly e PI Mackenzie. 1991. La superfamiglia del gene UPD-glucuronosiltransferasi: nomenclatura suggerita basata sulla divergenza evolutiva. DNA cellulare biologico 10: 487-494.

Burleson, G, A Munson e J Dean. 1995. Metodi moderni in immunotossicologia. New York: Wiley.

Capecchi, M. 1994. Sostituzione genica mirata. Sci Am 270: 52-59.

Carney, EW. 1994. Una prospettiva integrata sulla tossicità dello sviluppo del glicole etilenico. Rep Toxicolo 8: 99-113.

Dean, JH, MI Lustre, AE Munson e io Kimber. 1994. Immunotossicologia e immunofarmacologia. New York: Corvo Press.

Descotes, J. 1986. Immunotossicologia dei farmaci e dei prodotti chimici. AEKXNUMXNDH

Devary, Y, C Rosette, JA DiDonato e M Karin. 1993. Attivazione di NFkB mediante luce ultravioletta non dipendente da un segnale nucleare. Scienze 261: 1442-1445.

dennis the trickster dennis the menace milftoon Tossicologia riproduttiva. New York: Corvo Press.

Duffus, JH. 1993. Glossario per i chimici dei termini usati in tossicologia. Appl Chem puro 65: 2003-2122.

Elsenhans, B, K Schuemann e W Forth. 1991. Metalli tossici: interazioni con metalli essenziali. In Nutrizione, tossicità e cancro, a cura di IR Rowland. Boca-Raton: CRC Press.

Agenzia per la protezione dell'ambiente (EPA). 1992. Linee guida per la valutazione dell'esposizione. Reg. Federale 57: 22888-22938.

—. 1993. Principi di valutazione del rischio di neurotossicità. Reg. Federale 58: 41556-41598.

—. 1994. Linee guida per la valutazione della tossicità riproduttiva. Washington, DC: US ​​EPA: Ufficio di ricerca e sviluppo.

Fergusson, J.E. 1990. Gli elementi pesanti. Cap. 15 pollici Chimica, impatto ambientale ed effetti sulla salute. Oxford: Pergamo.

Gehring, PJ, PG Watanabe e GE Blau. 1976. Studi farmacocinetici nella valutazione del rischio tossicologico e ambientale delle sostanze chimiche. Nuovi concetti Saf Eval 1 (Parte 1, Capitolo 8): 195-270.

Goldstein, JA e SMF de Morais. 1994. Biochimica e biologia molecolare dell'essere umano CYP2C sottofamiglia. Farmacogenetica 4: 285-299.

González, FJ. 1992. Citocromi umani P450: Problemi e prospettive. Tendenze Pharmacol Sci 13: 346-352.

Gonzalez, FJ, CL Crespi e HV Gelboin. 1991. Citocromo umano P450 espresso da cDNA: una nuova era nella tossicologia molecolare e nella valutazione del rischio umano. Mutat Res 247: 113-127.

González, FJ e DW Nebert. 1990. Evoluzione della superfamiglia del gene P450: "guerra" animale-pianta, impulso molecolare e differenze genetiche umane nell'ossidazione dei farmaci. Tendenze Genet 6: 182-186.

Concedere, DM. 1993. Genetica molecolare delle N-acetiltransferasi. Farmacogenetica 3: 45-50.

Gray, LE, J Ostby, R Sigmon, J Ferrel, R Linder, R Cooper, J Goldman e J Laskey. 1988. Lo sviluppo di un protocollo per valutare gli effetti riproduttivi di sostanze tossiche nel ratto. Rep Toxicolo 2: 281-287.

Guengerich, FP. 1989. Polimorfismo del citocromo P450 nell'uomo. Tendenze Pharmacol Sci 10: 107-109.

—. 1993. Enzimi del citocromo P450. Sono Sci 81: 440-447.

Hansch, C e A Leone. 1979. Costanti sostituenti per l'analisi di correlazione in chimica e biologia. New York: Wiley.

Hansch, C e L Zhang. 1993. Relazioni quantitative struttura-attività del citocromo P450. Drug Metab Rev 25: 1-48.

Hayes A.W. 1988. Principi e metodi di tossicologia. 2a ed. New York: Corvo Press.

Heindell, JJ e RE Chapin. 1993. Metodi in tossicologia: tossicologia riproduttiva maschile e femminile. vol. 1 e 2. San Diego, California: Academic Press.

Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC). 1992. Radiazioni solari e ultraviolette. Lione: IARC.

—. 1993. Esposizioni professionali di parrucchieri e barbieri e uso personale di coloranti per capelli: alcune tinture per capelli, coloranti cosmetici, coloranti industriali e ammine aromatiche. Lione: IARC.

—. 1994a. Preambolo. Lione: IARC.

—. 1994 b. Alcuni prodotti chimici industriali. Lione: IARC.

Commissione internazionale per la protezione radiologica (ICRP). 1965. Principi di monitoraggio ambientale relativi alla manipolazione di materiali radioattivi. Rapporto del Comitato IV della Commissione Internazionale per la Protezione Radiologica. Oxford: Pergamo.

Programma internazionale sulla sicurezza chimica (IPCS). 1991. Principi e metodi per la valutazione della nefrotossicità associata all'esposizione a sostanze chimiche, EHC 119. Ginevra: OMS.

—. 1996. Principi e metodi per la valutazione Immunotossicità diretta associata all'esposizione a sostanze chimiche, EHC180. Ginevra: OMS.

Johanson, G. e PH Naslund. 1988. Programmazione di fogli di calcolo: un nuovo approccio nella modellazione su base fisiologica della tossicocinetica dei solventi. Lettere tossicologiche 41: 115-127.

înghițire de esperma,dominare,femdom,femdom pov,fetiș,umilire,umilire pov,interrasial, Prevenzione delle malattie neurotossiche nelle popolazioni lavoratrici. New York: Wiley.

Jones, JC, JM Ward, U Mohr e RD Hunt. 1990. Sistema Emopoietico, Monografia ILSI, Berlino: Springer Verlag.

: ta1962.wmv Farmacogenetica: ereditarietà e risposta ai farmaci. Filadelfia: WB Saunders.

—. 1992. Farmacogenetica del metabolismo dei farmaci. New York: Pergamo.

Kammüller, ME, N Bloksma e W Seinen. 1989. Autoimmunità e tossicologia. Disregolazione immunitaria indotta da farmaci e sostanze chimiche. Amsterdam: Scienze Elsevier.

Kawajiri, K, J Watanabe e SI Hayashi. 1994. Polimorfismo genetico di P450 e cancro umano. In Citocromo P450: Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare, a cura di MC Lechner. Parigi: John Libbey Eurotext.

Kehrer, J.P. 1993. Radicali liberi come mediatori di lesioni e malattie dei tessuti. Crit Rev Toxicol 23: 21-48.

Kellerman, G, CR Shaw e M. Luyten-Kellerman. 1973. Inducibilità dell'idrossilasi dell'idrocarburo arilico e carcinoma bronochogenico. New Engl J Med 289: 934-937.

Khera, KS. 1991. Alterazioni indotte chimicamente dall'omeostasi materna e dall'istologia del concepito: il loro significato eziologico nelle anomalie fetali del ratto. teratologia 44: 259-297.

Kimmel, CA, GL Kimmel e V Frankos. 1986. Seminario del gruppo di collegamento normativo tra agenzie sulla valutazione del rischio di tossicità riproduttiva. Ambiente Salute Persp 66: 193-221.

Klaassen, CD, MO Amdur e J Doull (a cura di). 1991. Tossicologia di Casarett e Doull. New York: Pergamo Press.

Kramer, HJ, EJHM Jansen, MJ Zeilmaker, HJ van Kranen e ED Kroese. 1995. Metodi quantitativi in ​​tossicologia per la valutazione dose-risposta umana. Rapporto RIVM n. 659101004.

Kress, S, C Sutter, PT Strickland, H Mukhtar, J Schweizer e M Schwarz. 1992. Schema mutazionale cancerogeno specifico nel gene p53 nei carcinomi a cellule squamose indotti da radiazioni ultraviolette B della pelle del topo. Cancer Res 52: 6400-6403.

Krewski, D, D Gaylor, M Szyazkowicz. 1991. Un approccio senza modello all'estrapolazione a basse dosi. Busta H pers 90: 270-285.

Lawton, MP, T Cresteil, AA Elfarra, E Hodgson, J Ozols, RM Philpot, AE Rettie, DE Williams, JR Cashman, CT Dolphin, RN Hines, T Kimura, IR Phillips, LL Poulsen, EA Shephare e DM Ziegler. 1994. Una nomenclatura per la famiglia di geni monoossigenasi contenente flavina dei mammiferi basata su identità di sequenze di amminoacidi. Arch Biochem Biophys 308: 254-257.

Lewalter, J e U Korallus. 1985. Coniugati di proteine ​​​​del sangue e acetilazione di ammine aromatiche. Nuove scoperte sul monitoraggio biologico. Int Arch Occupare Ambiente Salute 56: 179-196.

Majno, G e io Joris. 1995. Apoptosi, oncosi e necrosi: una panoramica della morte cellulare. Sono J Pathol 146: 3-15.

Mattison, DR e PJ Thomford. 1989. Il meccanismo d'azione delle sostanze tossiche per la riproduzione. Patolo tossico 17: 364-376.

Meyer, UA. 1994. Polimorfismi del citocromo P450 CYP2D6 come fattore di rischio nella carcinogenesi. In Citocromo P450: Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare, a cura di MC Lechner. Parigi: John Libbey Eurotext.

Moller, H, H Vainio e E Heseltine. 1994. Stima quantitativa e previsione del rischio presso l'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro. Cancro Ris 54:3625-3627.

Moolenaar, RJ. 1994. Assunzioni predefinite nella valutazione del rischio cancerogeno utilizzate dalle agenzie di regolamentazione. Regul Toxicol Farmaco 20: 135-141.

Moser, VC. 1990. Approcci di screening alla neurotossicità: una batteria di osservazione funzionale. J Am Coll tossico 1: 85-93.

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR). 1983. Valutazione del rischio nel governo federale: gestione del processo. Washington, DC: NAS Press.

—. 1989. Marcatori biologici nella tossicità riproduttiva. Washington, DC: NAS Press.

—. 1992. Marcatori biologici in immunotossicologia. Sottocommissione per la tossicologia. Washington, DC: NAS Press.

Nebert, DW. 1988. Geni che codificano per gli enzimi che metabolizzano i farmaci: possibile ruolo nella malattia umana. In Variazione fenotipica nelle popolazioni, a cura di AD Woodhead, MA Bender e RC Leonard. New York: Pubblicazione Plenum.

—. 1994. Enzimi che metabolizzano farmaci nella trascrizione modulata dal ligando. Biochem Pharmacol 47: 25-37.

Nebert, DW e WW Weber. 1990. Farmacogenetica. In Principi di azione dei farmaci. Le basi della farmacologia, a cura di WB Pratt e PW Taylor. New York: Churchill-Livingstone.

Nebert, DW e DR Nelson. 1991. Nomenclatura del gene P450 basata sull'evoluzione. In Metodi di Enzimologia. Citocromo P450, a cura di MR Waterman e EF Johnson. Orlando, Florida: stampa accademica.

Nebert, DW e RA McKinnon. 1994. Citocromo P450: Evoluzione e diversità funzionale. Prog Live Dis 12: 63-97.

Nebert, DW, M Adesnik, MJ Coon, RW Estabrook, FJ Gonzalez, FP Guengerich, IC Gunsalus, EF Johnson, B Kemper, W Levin, IR Phillips, R Sato e MR Waterman. 1987. La superfamiglia del gene P450: nomenclatura consigliata. DNA cellulare biologico 6: 1-11.

Nebert, DW, DR Nelson, MJ Coon, RW Estabrook, R Feyereisen, Y Fujii-Kuriyama, FJ Gonzalez, FP Guengerich, IC Gunsalas, EF Johnson, JC Loper, R Sato, MR Waterman e DJ Waxman. 1991. La superfamiglia P450: aggiornamento su nuove sequenze, mappatura genica e nomenclatura raccomandata. DNA cellulare biologico 10: 1-14.

Nebert, DW, DD Petersen e A Puga. 1991. Polimorfismo e cancro del locus AH umano: inducibilità del CYP1A1 e di altri geni mediante prodotti di combustione e diossina. Farmacogenetica 1: 68-78.

Nebert, DW, A Puga e V Vasiliou. 1993. Ruolo del recettore Ah e della batteria del gene [Ah] inducibile dalla diossina nella tossicità, nel cancro e nella trasduzione del segnale. Ann NY Acad Sci 685: 624-640.

Nelson, DR, T Kamataki, DJ Waxman, FP Guengerich, RW Estabrook, R Feyereisen, FJ Gonzalez, MJ Coon, IC Gunsalus, O Gotoh, DW Nebert e K Okuda. 1993. La superfamiglia P450: aggiornamento su nuove sequenze, mappatura genica, numeri di accessione, primi nomi banali di enzimi e nomenclatura. DNA cellulare biologico 12: 1-51.

Nicholson, DW, A All, NA Thornberry, JP Vaillancourt, CK Ding, M Gallant, Y Gareau, PR Griffin, M Labelle, YA Lazebnik, NA Munday, SM Raju, ME Smulson, TT Yamin, VL Yu e DK Miller. 1995. Identificazione e inibizione della proteasi ICE/CED-3 necessaria per l'apoptosi dei mammiferi. Natura 376: 37-43.

Nolan, RJ, WT Stott e PG Watanabe. 1995. Dati tossicologici nella valutazione della sicurezza chimica. Cap. 2 dentro Igiene industriale e tossicologia di Patty, a cura di LJ Cralley, LV Cralley e JS Bus. New York: John Wiley & Figli.

Nordberg, GF. 1976. Effetto e relazioni dose-risposta dei metalli tossici. AEKXNUMXNDH

Ufficio di valutazione della tecnologia (OTA). 1985. Rischi riproduttivi sul posto di lavoro. Documento n. OTA-BA-266. Washington, DC: ufficio stampa del governo.

—. 1990. Neurotossicità: identificazione e controllo dei veleni del sistema nervoso. Documento n. OTA-BA-436. Washington, DC: ufficio stampa del governo.

Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE). 1993. Progetto congiunto US EPA/CE sulla valutazione delle relazioni (quantitative) struttura-attività. Parigi: OCSE.

Parco, CN e NC Hawkins. 1993. Revisione della tecnologia; una panoramica della valutazione del rischio di cancro. Metodi tossici 3: 63-86.

Pease, W, J Vandenberg e WK Hooper. 1991. Confronto di approcci alternativi per stabilire livelli normativi per sostanze tossiche per la riproduzione: DBCP come caso di studio. Ambiente Salute Persp 91: 141-155.

Prpi ƒ -Maji ƒ , D, S Telišman e S Kezi ƒ . 6.5. Studio in vitro sull'interazione tra piombo e alcol e sull'inibizione dell'acido deidratasi eritrocitaria delta-aminolevulinico nell'uomo. Scand J Ambiente di lavoro Salute 10: 235-238.

Reitz, RH, RJ Nolan e AM Schumann. 1987. Sviluppo di modelli farmacocinetici multispecie e multivia per cloruro di metilene e 1,1,1-tricloroetano. In Farmacocinetica e valutazione del rischio, acqua potabile e salute. Washington, DC: Stampa dell'Accademia Nazionale.

Roitt, io, J Brostoff e D maschio. 1989. Immunologia. Londra: Gower Medical Publishing.

Sato, A. 1991. L'effetto dei fattori ambientali sul comportamento farmacocinetico dei vapori di solventi organici. Ann Occupare Hyg 35: 525-541.

Silbergeld, EK. 1990. Sviluppo di metodi formali di valutazione del rischio per neurotossici: una valutazione dello stato dell'arte. In Progressi nella tossicologia neurocomportamentale, a cura di BL Johnson, WK Anger, A Durao e C Xintaras. Chelsea, Michigan: Lewis.

Spencer, PS e HH Schaumberg. 1980. Neurotossicologia sperimentale e clinica. Baltimora: Williams & Wilkins.

Sweeney, AM, MR Meyer, JH Aarons, JL Mills e RE LePorte. 1988. Valutazione dei metodi per l'identificazione prospettica delle perdite fetali precoci negli studi di epidemiologia ambientale. Am J Epidemiol 127: 843-850.

Taylor, BA, HJ Heiniger e H Meier. 1973. Analisi genetica della resistenza al danno testicolare indotto dal cadmio nei topi. Proc Soc Exp Biol Med 143: 629-633.

Telišman, S. 1995. Interazioni di metalli e metalloidi essenziali e/o tossici riguardanti le differenze interindividuali nella suscettibilità a varie sostanze tossiche e malattie croniche nell'uomo. Arh rig rada toksikol 46: 459-476.

Telišman, S, A Pinent, e D Prpi ƒ -Maji ƒ . 6.5. Interferenza del piombo nel metabolismo dello zinco e interazione tra piombo e zinco nell'uomo come possibile spiegazione dell'apparente suscettibilità individuale al piombo. In Metalli pesanti nell'ambiente, a cura di RJ Allan e JO Nriagu. Edimburgo: Consulenti CEP.

Telisman, S, D Prpi ƒ -Maji ƒ , e S Kezi ƒ . 6.5. Studio in vivo sull'interazione tra piombo e alcol e sull'inibizione dell'acido deidratasi eritrocitaria delta-aminolevulinico nell'uomo. Scand J Ambiente di lavoro Salute 10: 239-244.

Tilson, HA e PA Cabe. 1978. Strategie per la valutazione delle conseguenze neurocomportamentali dei fattori ambientali. Ambiente Salute Persp 26: 287-299.

Trump, BF e AU Arstila. 1971. Lesione cellulare e morte cellulare. In Principi di patobiologia, a cura di MF LaVia e RB Hill Jr. New York: Oxford Univ. Premere.

Trump, BF e IK Berezesky. 1992. Il ruolo del Ca2 citosolico + danno cellulare, necrosi e apoptosi. Curr Opinioni Cell Biol 4: 227-232.

—. 1995. Lesione cellulare mediata dal calcio e morte cellulare. FASEB J 9: 219-228.

Trump, BF, IK Berezesky e A Osornio-Vargas. 1981. Morte cellulare e processo patologico. Il ruolo del calcio cellulare. In Morte cellulare in biologia e patologia, a cura di ID Bowen e RA Lockshin. Londra: Chapman & Hall.

Vos, JG, M Younes e E Smith. 1995. Ipersensibilità allergiche indotte da sostanze chimiche: raccomandazioni per la prevenzione pubblicate per conto dell'Ufficio regionale per l'Europa dell'Organizzazione mondiale della sanità. Boca Raton, Florida: CRC Press.

Weber, W.W. 1987. I geni dell'acetilatore e la risposta ai farmaci. New York: Università di Oxford. Premere.

Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). 1980. Limiti sanitari consigliati per l'esposizione professionale a metalli pesanti. Technical Report Series, n. 647. Ginevra: OMS.

—. 1986. Principi e metodi per la valutazione della neurotossicità associata all'esposizione a sostanze chimiche. Criteri di salute ambientale, n. 60. Ginevra: OMS.

—. 1987. Linee guida sulla qualità dell'aria per l'Europa. Serie europea, n. 23. Copenaghen: pubblicazioni regionali dell'OMS.

—. 1989. Glossario dei termini sulla sicurezza chimica per l'uso nelle pubblicazioni IPCS. Ginevra: OMS.

—. 1993. La derivazione dei valori guida per i limiti di esposizione basati sulla salute. Criteri di salute ambientale, bozza inedita. Ginevra: OMS.

Wyllie, AH, JFR Kerr e AR Currie. 1980. Morte cellulare: il significato dell'apoptosi. Zizare handiko engranajea altxatzen da Txina onena Bangalore Indiako zehaztasun espiral alaka engranaje metalezko gurpil txikia kalitate gorenarekin 68: 251-306.

@REFS LABEL = Altre letture rilevanti

Alberto, RE. 1994. Valutazione del rischio cancerogeno nella US Environmental Protection Agency. Critico. Rev. Toxicol 24: 75-85.

Alberts, B, D Bray, J Lewis, M Raff, K Roberts e JD Watson. 1988. Biologia molecolare della cellula. New York: Garland Publishing.

เคิร์นและโซห์น Ccs 1964k-XNUMXu | ระบบการนับ น้ำหนักสูงสุด XNUMXกก. | Farmacologia molecolare. Vol.1. New York: stampa accademica.

Ariens, EJ, E Mutschler e AM Simonis. 1978. Allgemeine Toxicologie [Tossicologia generale]. Stoccarda: Georg Thieme Verlag.

Ashby, J e RW Tennant. 1994. Previsione della cancerogenicità nei roditori per 44 sostanze chimiche: risultati. mutagenesi 9: 7-15.

Ashford, NA, CJ Spadafor, DB Hattis e CC Caldart. 1990. Monitoraggio del lavoratore per l'esposizione e la malattia. Baltimora: Johns Hopkins Univ. Premere.

Balabuha, NS e GE Fradkin. 1958. Nakoplenie radioaktivnih elementov v organizme I ih vivedenie [Accumulo di elementi radioattivi nell'organismo e loro escrezione]. Mosca: Medgiz.

Balls, M, J Bridges e J Southee. 1991. Animali e alternative in tossicologia Stato attuale e prospettive future. Nottingham, Regno Unito: Fondo per la sostituzione degli animali negli esperimenti medici.

Berlin, A, J Dean, MH Draper, EMB Smith e F Spreafico. 1987. Immunotossicologia. Dordrecht: Martinus Nijoff.

BloggersIdeas.com Respirazione. New York: Grune & Stratton.

Brandau, R e BH Lippold. 1982. Assorbimento dermico e transdermico. Stoccarda: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft.

Brusic, DJ. 1994. Metodi per la valutazione del rischio genetico. Boca Raton: Lewis Editori.

Burrell, R. 1993. Tossicità immunitaria umana. Mol Aspetti Med 14: 1-81.

Castell, JV e MJ Gómez-Lechón. 1992. Alternative in vitro alla farmaco-tossicologia animale. Madrid, Spagna: Farmaindustria.

Chapmann, G. 1967. Fluidi corporei e loro funzioni. Londra: Edward Arnold.

Commissione Marcatori Biologici del Consiglio Nazionale delle Ricerche. 1987. Indicatori biologici nella ricerca sulla salute ambientale. Ambiente Salute Persp 74: 3-9.

Cralley, LJ, LV Cralley e JS Bus (a cura di). 1978. Igiene industriale e tossicologia di Patty. New York: Witey.

Dayan, AD, RF Hertel, E Heseltine, G Kazantis, EM Smith e MT Van der Venne. 1990. Immunotossicità dei metalli e immunotossicologia. Purwanchal_vm@rediffmail.com

Djuric, D. 1987. Aspetti molecolari-cellulari dell'esposizione professionale a sostanze chimiche tossiche. In Parte 1 Tossicocinetica. Ginevra: OMS.

PDKT Tossicologia ambientale. Londra: Edward Arnold.

1986 femdom pov Relazione struttura-attività in tossicologia ed ecotossicologia, monografia n. 8. Bruxelles: ECOTOC.

Forth, W, D Henschler e W Rummel. 1983. Farmacologia e tossicologia. Mannheim: Bibliographische Institut.

XNL1990A-XNUMX Criteri scientifici per la convalida dei test di tossicità in vitro. Monografia ambientale dell'OCSE, n. 36. Parigi: OCSE.

—. 1992. Tossicità in vitro: applicazioni alla valutazione della sicurezza. New York: Marcel Dekker.

Gad, SC. 1994. Tossicologia in vitro. New York: Corvo Press.

Gadaskina, ID. 1970. Zhiroraya tkan I yadi [Tessuti grassi e sostanze tossiche]. In Aktualnie Vaprosi promishlenoi toksikolgii [Problemi reali in tossicologia occupazionale], a cura di NV Lazarev. Leningrado: Ministero della Salute RSFSR.

Gaylor, DW. 1983. L'uso dei fattori di sicurezza per il controllo del rischio. J Toxicol Ambiente Salute 11: 329-336.

Gibson, GG, R Hubbard e DV Parke. 1983. Immunotossicologia. Londra: stampa accademica.

Goldberg, A.M. 1983-1995. Alternative in tossicologia. vol. 1-12. New York: Mary Ann Liebert.

Grandjean, P. 1992. Suscettibilità individuale alla tossicità. Lettere tossicologiche 64 / 65: 43-51.

Hanke, J e JK Piotrowski. 1984. Biochemyczne podstawy toksikologii [Basi biochimiche della tossicologia]. Varsavia: PZWL.

Portello, T e P Gross. 1954. Deposizione polmonare e ritenzione di aerosol inalati. New York: stampa accademica.

Consiglio sanitario dei Paesi Bassi: Comitato per la valutazione della cancerogenicità delle sostanze chimiche. 1994. Valutazione del rischio di sostanze chimiche cancerogene nei Paesi Bassi. Regul Toxicol Farmaco 19: 14-30.

Olanda, WC, RL Klein e AH Briggs. 1967. Farmacologia Molecolare.

Huff, J.E. 1993. Sostanze chimiche e cancro negli esseri umani: prima prova negli animali da esperimento. Ambiente Salute Persp 100: 201-210.

Klaassen, CD e DL Eaton. 1991. Principi di tossicologia. Cap. 2 dentro Tossicologia di Casarett e Doull, a cura di CD Klaassen, MO Amdur e J Doull. New York: Pergamo Press.

Kossover, E.M. 1962. Biochimica molecolare. New York: McGraw-Hill.

Kundiev, YI. 1975.Vssavanie pesticidov cherez kozsu I profilaktika otravlenii [Assorbimento di pesticidi attraverso la pelle e prevenzione dell'intossicazione]. Kiev: Zdorovia.

Kustov, VV, LA Tiunov e JA Vasiljev. 1975. Komvinovanie deistvie promishlenih yadov [Effetti combinati di sostanze tossiche industriali]. Mosca: Medicina.

Lauwerys, R. 1982. Tossicologie industrielle et intossicazioni professionali. Parigi: Masson.

Li, AP e RH Heflich. 1991. Tossicologia genetica. วาล์วระบายความปลอดภัย ขนาดทางเข้า XNUMX/XNUMX นิ้ว XNUMX PSI สเตนเลส | CNXNUMXAJA - ชำระเป็น EUR | จัดส่งทั่วไทย |

Loewey, AG e P. Siekewitz. 1969. Struttura e funzioni delle cellule. New York: Holt, Reinhart e Winston.

จาก นิวสมา ภัทรนนคร Elementi essenziali di tossicologia. Filadelfia: Lea & Febiger.

Mendelsohn, ML e RJ Albertini. 1990. Mutazione e ambiente, parti AE. Îi vei suge penisul și îi vei înghiți sperma video porno gay. Înghițire perfectă de sperma, fetiș, video interracial cu băieți fierbinți. Verificați mii de videoclipuri porno gay din categorii precum Deepthroat, Anal sau Bareback.

Metzler, DE. 1977. Biochimica. New York: stampa accademica.

Miller, K, JL Turk e S Nicklin. 1992. Principi e pratica di immunotossicologia. Oxford: Blackwell Scientific.

Ministero del Commercio Internazionale e dell'Industria. 1981. Manuale delle sostanze chimiche esistenti. Tokyo: stampa quotidiana chimica.

—. 1987. Domanda di approvazione di sostanze chimiche da parte della legge sul controllo delle sostanze chimiche. (In giapponese e in inglese). Tokio: Kagaku Kogyo Nippo Press.

Montagna, W. 1956. La struttura e la funzione della pelle. New York: stampa accademica.

Moolenaar, RJ. 1994. Valutazione del rischio cancerogeno: confronto internazionale. RHare-Kon. 20: 302-336.

Consiglio Nazionale per la Ricerca. 1989. Marcatori biologici nella tossicità riproduttiva. Washington, DC: NAS Press.

Neuman, WG e M. Neuman. 1958. La dinamica chimica dei minerali ossei. Chicago: l'univ. della Chicago Press.

Newcombe, DS, NR Rose e JC Bloom. 1992. Immunotossicologia clinica. New York: Corvo Press.

Pacheco, H.1973. La farmacologia molecolare. Parigi: Presse Universitaire.

Piotrowski, JK. 1971. L'applicazione della cinetica metabolica ed escretoria ai problemi di tossicologia industriale. Washington, DC: Dipartimento della salute, dell'istruzione e del benessere degli Stati Uniti.

—. 1983. Interazioni biochimiche di metalli pesanti: Metalotioneina. In Effetti sulla salute dell'esposizione combinata a sostanze chimiche. Copenaghen: Ufficio regionale dell'OMS per l'Europa.

Atti della conferenza Arnold O. Beckman/IFCC sui biomarcatori di tossicologia ambientale dell'esposizione chimica. 1994. Clin Chem 40(7B).

Russell, WMS e RL Burch. 1959. I principi della tecnica sperimentale umana. Londra: Methuen & Co. Ristampato dalla Universities Federation for Animal Welfare, 1993.

Rycroft, RJG, T Menné, PJ Frosch e C Benezra. 1992. Manuale di dermatite da contatto. Berlino: Springer-Verlag.

Schubert, J. 1951. Stima dei radioelementi negli individui esposti. Nucleonica 8: 13-28.

Shelby, MD ed E Zeiger. 1990. Attività di agenti cancerogeni umani nei test di citogenetica del midollo osseo di roditori e salmonella. Mutat Res 234: 257-261.

Stone, R. 1995. Un approccio molecolare al rischio di cancro. Scienze 268: 356-357.

Teisinger, J. 1984. Test di esposizione nella tossicologia industriale [Test di esposizione in tossicologia industriale]. Berlino: VEB Verlag Volk und Gesundheit.

Congresso degli Stati Uniti. 1990. Monitoraggio genetico e screening sul posto di lavoro, OTA-BA-455. Washington, DC: ufficio stampa del governo degli Stati Uniti.

VEB. 1981. Kleine Enzyklopaedie: Leben [Vita]. Lipsia: VEB Bibliographische Institut.

Weil, E. 1975. Elementi di tossicologia industriale [Elementi di Tossicologia Industriale]. Parigi: Masson et Cie.

Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). 1975. Metodi utilizzati in URSS per stabilire livelli sicuri di sostanze tossiche. Ginevra: OMS.

1978 Principi e metodi per valutare la tossicità delle sostanze chimiche, parte 1. Criteri di salute ambientale, n.6. Ginevra: OMS.

—. 1981. Esposizione combinata a sostanze chimiche, documento provvisorio n.11. Copenaghen: Ufficio regionale dell'OMS per l'Europa.

—. 1986. Principi di studi tossicocinetici. Criteri di salute ambientale, n. 57. Ginevra: OMS.

Yoftrey, JM e FC Courtice. 1956. Linfatici, linfa e tessuto linfoide. Cambridge: Università di Harvard. Premere.

Zakutinsky, DI. 1959. Voprosi toksikologii radioaktivnih veshchestv [Problemi di tossicologia dei materiali radioattivi]. Mosca: Medgiz.

Zurlo, J, D Rudacille e AM Goldberg. 1993. Animali e alternative nei test: storia, scienza ed etica. New York: Mary Ann Liebert.