A palavra biomarcador é a abreviação de marcador biológico, um termo que se refere a um evento mensurável que ocorre em um sistema biológico, como o corpo humano. Esse evento é então interpretado como um reflexo, ou marcador, de um estado mais geral do organismo ou da expectativa de vida. Na saúde ocupacional, um biomarcador é geralmente usado como um indicador do estado de saúde ou risco de doença.

Os biomarcadores são usados ​​para estudos in vitro e in vivo que podem incluir seres humanos. Normalmente, três tipos específicos de marcadores biológicos são identificados. Embora alguns biomarcadores possam ser difíceis de classificar, geralmente eles são separados em biomarcadores de exposição, biomarcadores de efeito ou biomarcadores de suscetibilidade (ver tabela 1).

Tabela 1. Exemplos de biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito que são utilizados em estudos toxicológicos em saúde ocupacional

Dado um grau aceitável de validade, os biomarcadores podem ser empregados para diversos fins. Em uma base individual, um biomarcador pode ser usado para apoiar ou refutar um diagnóstico de um determinado tipo de envenenamento ou outro efeito adverso induzido quimicamente. Em um indivíduo saudável, um biomarcador também pode refletir a hipersuscetibilidade individual a exposições químicas específicas e, portanto, servir como base para previsão de risco e aconselhamento. Em grupos de trabalhadores expostos, alguns biomarcadores de exposição podem ser aplicados para avaliar a extensão da conformidade com os regulamentos de redução da poluição ou a eficácia dos esforços preventivos em geral.

Biomarcadores de Exposição

Um biomarcador de exposição pode ser um composto exógeno (ou um metabólito) dentro do corpo, um produto interativo entre o composto (ou metabólito) e um componente endógeno ou outro evento relacionado à exposição. Mais comumente, os biomarcadores de exposições a compostos estáveis, como metais, compreendem medições das concentrações de metais em amostras apropriadas, como sangue, soro ou urina. Com produtos químicos voláteis, sua concentração na respiração exalada (após a inalação de ar livre de contaminação) pode ser avaliada. Se o composto for metabolizado no corpo, um ou mais metabólitos podem ser escolhidos como biomarcadores da exposição; os metabolitos são frequentemente determinados em amostras de urina.

Métodos modernos de análise podem permitir a separação de isômeros ou congêneres de compostos orgânicos e a determinação da especiação de compostos metálicos ou proporções isotópicas de certos elementos. Análises sofisticadas permitem a determinação de mudanças na estrutura do DNA ou outras macromoléculas causadas pela ligação com produtos químicos reativos. Sem dúvida, essas técnicas avançadas ganharão consideravelmente em importância para aplicações em estudos de biomarcadores, e limites de detecção mais baixos e melhor validade analítica provavelmente tornarão esses biomarcadores ainda mais úteis.

Desenvolvimentos particularmente promissores ocorreram com biomarcadores de exposição a produtos químicos mutagênicos. Esses compostos são reativos e podem formar adutos com macromoléculas, como proteínas ou DNA. Adutos de DNA podem ser detectados em glóbulos brancos ou biópsias de tecidos, e fragmentos específicos de DNA podem ser excretados na urina. Por exemplo, a exposição ao óxido de etileno resulta em reações com as bases do DNA e, após a excisão da base danificada, a N-7-(2-hidroxietil)guanina será eliminada na urina. Alguns adutos podem não se referir diretamente a uma exposição específica. Por exemplo, a 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina reflete o dano oxidativo ao DNA, e essa reação pode ser desencadeada por vários compostos químicos, muitos dos quais também induzem a peroxidação lipídica.

Outras macromoléculas também podem ser alteradas pela formação de adutos ou oxidação. De especial interesse, tais compostos reativos podem gerar adutos de hemoglobina que podem ser determinados como biomarcadores de exposição aos compostos. A vantagem é que grandes quantidades de hemoglobina podem ser obtidas a partir de uma amostra de sangue e, dada a vida útil de quatro meses das hemácias, os adutos formados com os aminoácidos da proteína indicarão a exposição total nesse período.

Os adutos podem ser determinados por técnicas sensíveis, como cromatografia lipídica de alta eficiência, e alguns métodos imunológicos também estão disponíveis. Em geral, os métodos analíticos são novos, caros e precisam de mais desenvolvimento e validação. Melhor sensibilidade pode ser obtida usando o ³²P pós-ensaio de marcação, que é uma indicação inespecífica de que ocorreu dano ao DNA. Todas essas técnicas são potencialmente úteis para monitoramento biológico e têm sido aplicadas em um número crescente de estudos. No entanto, métodos analíticos mais simples e sensíveis são necessários. Dada a especificidade limitada de alguns métodos em exposições de baixo nível, o tabagismo ou outros fatores podem ter um impacto significativo nos resultados da medição, causando dificuldades de interpretação.

A exposição a compostos mutagênicos, ou a compostos que são metabolizados em mutagênicos, também pode ser determinada pela avaliação da mutagenicidade da urina de um indivíduo exposto. A amostra de urina é incubada com uma cepa de bactéria na qual uma mutação pontual específica é expressa de uma forma que pode ser facilmente medida. Se produtos químicos mutagênicos estiverem presentes na amostra de urina, ocorrerá um aumento na taxa de mutações nas bactérias.

Os biomarcadores de exposição devem ser avaliados em relação à variação temporal da exposição e à relação com os diferentes compartimentos. Assim, o(s) período(s) de tempo representado(s) pelo biomarcador, ou seja, até que ponto a medição do biomarcador reflete a(s) exposição(ões) passada(s) e/ou carga corporal acumulada, deve(m) ser determinado(s) a partir de dados toxicocinéticos para interpretar o resultado. Em particular, o grau em que o biomarcador indica retenção em órgãos-alvo específicos deve ser considerado. Embora as amostras de sangue sejam frequentemente usadas para estudos de biomarcadores, o sangue periférico geralmente não é considerado um compartimento como tal, embora atue como um meio de transporte entre os compartimentos. O grau em que a concentração no sangue reflete os níveis em diferentes órgãos varia amplamente entre diferentes produtos químicos e geralmente também depende da duração da exposição, bem como do tempo desde a exposição.

Às vezes, esse tipo de evidência é usado para classificar um biomarcador como um indicador de dose (total) absorvida ou um indicador de dose efetiva (ou seja, a quantidade que atingiu o tecido-alvo). Por exemplo, a exposição a um determinado solvente pode ser avaliada a partir de dados sobre a concentração real do solvente no sangue em um determinado momento após a exposição. Essa medição refletirá a quantidade de solvente que foi absorvida pelo corpo. Parte da quantidade absorvida será exalada devido à pressão de vapor do solvente. Ao circular no sangue, o solvente interagirá com vários componentes do corpo e, eventualmente, ficará sujeito à degradação por enzimas. O resultado dos processos metabólicos pode ser avaliado pela determinação de ácidos mercaptúricos específicos produzidos por conjugação com glutationa. A excreção cumulativa de ácidos mercaptúricos pode refletir melhor a dose efetiva do que a concentração sanguínea.

Eventos da vida, como reprodução e senescência, podem afetar a distribuição de uma substância química. A distribuição de produtos químicos dentro do corpo é significativamente afetada pela gravidez, e muitos produtos químicos podem atravessar a barreira placentária, causando assim a exposição do feto. A lactação pode resultar na excreção de substâncias químicas lipossolúveis, levando assim a uma diminuição da retenção na mãe, juntamente com uma maior absorção pelo lactente. Durante a perda de peso ou desenvolvimento de osteoporose, produtos químicos armazenados podem ser liberados, o que pode resultar em uma exposição “endógena” renovada e prolongada de órgãos-alvo. Outros fatores podem afetar a absorção individual, metabolismo, retenção e distribuição de compostos químicos, e alguns biomarcadores de suscetibilidade estão disponíveis (ver abaixo).

Biomarcadores de Efeito

Um marcador de efeito pode ser um componente endógeno, ou uma medida da capacidade funcional, ou algum outro indicador do estado ou equilíbrio do corpo ou sistema orgânico, conforme afetado pela exposição. Esses marcadores de efeito são geralmente indicadores pré-clínicos de anormalidades.

Esses biomarcadores podem ser específicos ou inespecíficos. Os biomarcadores específicos são úteis porque indicam um efeito biológico de uma determinada exposição, fornecendo assim evidências que podem ser potencialmente utilizadas para fins preventivos. Os biomarcadores não específicos não apontam para uma causa individual do efeito, mas podem refletir o efeito total e integrado devido a uma exposição mista. Ambos os tipos de biomarcadores podem, portanto, ser de uso considerável na saúde ocupacional.

Não há uma distinção clara entre biomarcadores de exposição e biomarcadores de efeito. Por exemplo, pode-se dizer que a formação do aduto reflete um efeito e não a exposição. No entanto, os biomarcadores de efeito geralmente indicam alterações nas funções das células, tecidos ou do corpo inteiro. Alguns pesquisadores incluem alterações grosseiras, como aumento do peso do fígado de animais de laboratório expostos ou diminuição do crescimento em crianças, como biomarcadores de efeito. Para fins de saúde ocupacional, os biomarcadores de efeito devem ser restritos àqueles que indicam alterações bioquímicas subclínicas ou reversíveis, como inibição de enzimas. O biomarcador de efeito mais utilizado é provavelmente a inibição da colinesterase causada por certos inseticidas, ou seja, organofosforados e carbamatos. Na maioria dos casos, esse efeito é totalmente reversível e a inibição da enzima reflete a exposição total a esse grupo específico de inseticidas.

Algumas exposições não resultam na inibição da enzima, mas sim no aumento da atividade de uma enzima. É o caso de várias enzimas pertencentes à família P450 (ver “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Eles podem ser induzidos por exposições a certos solventes e hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs). Uma vez que essas enzimas são expressas principalmente em tecidos dos quais uma biópsia pode ser difícil de obter, a atividade enzimática é determinada indiretamente in vivo pela administração de um composto que é metabolizado por essa enzima específica e, em seguida, o produto de decomposição é medido na urina ou no plasma.

Outras exposições podem induzir a síntese de uma proteína protetora no organismo. O melhor exemplo é provavelmente a metalotioneína, que se liga ao cádmio e promove a excreção desse metal; a exposição ao cádmio é um dos fatores que resultam no aumento da expressão do gene da metalotioneína. Proteínas protetoras semelhantes podem existir, mas ainda não foram suficientemente exploradas para serem aceitas como biomarcadores. Entre os candidatos a possíveis usos como biomarcadores estão as chamadas proteínas de estresse, originalmente chamadas de proteínas de choque térmico. Essas proteínas são geradas por uma variedade de organismos diferentes em resposta a uma variedade de exposições adversas.

O dano oxidativo pode ser avaliado pela determinação da concentração de malondialdeído no soro ou pela exalação de etano. Da mesma forma, a excreção urinária de proteínas de baixo peso molecular, como a albumina, pode ser utilizada como biomarcador de lesão renal precoce. Vários parâmetros usados ​​rotineiramente na prática clínica (por exemplo, níveis séricos de hormônios ou enzimas) também podem ser úteis como biomarcadores. No entanto, muitos desses parâmetros podem não ser suficientemente sensíveis para detectar comprometimento precoce.

Outro grupo de parâmetros de efeito refere-se aos efeitos genotóxicos (alterações na estrutura dos cromossomos). Tais efeitos podem ser detectados por microscopia de glóbulos brancos que sofrem divisão celular. Danos sérios aos cromossomos – aberrações cromossômicas ou formação de micronúcleos – podem ser vistos em um microscópio. Os danos também podem ser revelados pela adição de um corante às células durante a divisão celular. A exposição a um agente genotóxico pode então ser visualizada como uma troca aumentada do corante entre as duas cromátides de cada cromossomo (troca de cromátides-irmãs). As aberrações cromossômicas estão relacionadas a um risco aumentado de desenvolver câncer, mas o significado de uma taxa aumentada de troca de cromátides-irmãs é menos claro.

Uma avaliação mais sofisticada da genotoxicidade é baseada em mutações pontuais específicas em células somáticas, isto é, glóbulos brancos ou células epiteliais obtidas da mucosa oral. Uma mutação em um locus específico pode tornar as células capazes de crescer em uma cultura que contém uma substância química tóxica (como a 6-tioguanina). Alternativamente, um produto gênico específico pode ser avaliado (por exemplo, concentrações séricas ou teciduais de oncoproteínas codificadas por oncogenes específicos). Obviamente, essas mutações refletem o dano genotóxico total incorrido e não necessariamente indicam nada sobre a exposição causadora. Esses métodos ainda não estão prontos para uso prático em saúde ocupacional, mas o rápido progresso nessa linha de pesquisa sugere que tais métodos estarão disponíveis dentro de alguns anos.

Biomarcadores de Suscetibilidade

Um marcador de suscetibilidade, herdada ou induzida, é um indicador de que o indivíduo é particularmente sensível ao efeito de um xenobiótico ou aos efeitos de um grupo desses compostos. A maior parte da atenção tem sido focada na suscetibilidade genética, embora outros fatores possam ser pelo menos tão importantes. A hipersuscetibilidade pode ser devida a uma característica hereditária, à constituição do indivíduo ou a fatores ambientais.

A capacidade de metabolizar certos produtos químicos é variável e é determinada geneticamente (consulte “Determinantes genéticos da resposta tóxica”). Várias enzimas relevantes parecem ser controladas por um único gene. Por exemplo, a oxidação de produtos químicos estranhos é realizada principalmente por uma família de enzimas pertencentes à família P450. Outras enzimas tornam os metabólitos mais solúveis em água por conjugação (por exemplo, N-acetiltransferase e μ-glutationa).S-transferase). A atividade dessas enzimas é controlada geneticamente e varia consideravelmente. Conforme mencionado acima, a atividade pode ser determinada pela administração de uma pequena dose de um medicamento e, em seguida, pela determinação da quantidade do metabólito na urina. Alguns dos genes já foram caracterizados e as técnicas estão disponíveis para determinar o genótipo. Estudos importantes sugerem que o risco de desenvolver certas formas de câncer está relacionado à capacidade de metabolizar compostos estranhos. Muitas questões ainda permanecem sem resposta, limitando, neste momento, o uso desses potenciais biomarcadores de suscetibilidade na saúde ocupacional.

Outros traços herdados, como alfa₁-deficiência de antitripsina ou deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase, também resultam em mecanismos de defesa deficientes no corpo, causando hipersuscetibilidade a certas exposições.

A maioria das pesquisas relacionadas à suscetibilidade tratou da predisposição genética. Outros fatores também desempenham um papel e foram parcialmente negligenciados. Por exemplo, indivíduos com uma doença crônica podem ser mais sensíveis a uma exposição ocupacional. Além disso, se um processo de doença ou exposição anterior a substâncias químicas tóxicas causou algum dano subclínico de órgão, é provável que a capacidade de resistir a uma nova exposição tóxica seja menor. Os indicadores bioquímicos da função do órgão podem, neste caso, ser usados ​​como biomarcadores de suscetibilidade. Talvez o melhor exemplo em relação à hipersuscetibilidade esteja relacionado às respostas alérgicas. Se um indivíduo se tornou sensível a uma exposição específica, anticorpos específicos podem ser detectados no soro. Mesmo que o indivíduo não tenha se tornado sensibilizado, outras exposições atuais ou passadas podem aumentar o risco de desenvolver um efeito adverso relacionado a uma exposição ocupacional.

Um grande problema é determinar o efeito conjunto de exposições mistas no trabalho. Além disso, hábitos pessoais e uso de drogas podem resultar em maior suscetibilidade. Por exemplo, a fumaça do tabaco geralmente contém uma quantidade considerável de cádmio. Assim, com a exposição ocupacional ao cádmio, um fumante inveterado que acumulou quantidades substanciais desse metal no corpo terá maior risco de desenvolver doença renal relacionada ao cádmio.

Aplicação em Saúde Ocupacional

Os biomarcadores são extremamente úteis na pesquisa toxicológica e muitos podem ser aplicáveis ​​no monitoramento biológico. No entanto, as limitações também devem ser reconhecidas. Muitos biomarcadores até agora foram estudados apenas em animais de laboratório. Os padrões toxicocinéticos em outras espécies podem não refletir necessariamente a situação em seres humanos, e a extrapolação pode exigir estudos confirmatórios em voluntários humanos. Além disso, deve-se levar em consideração as variações individuais devido a fatores genéticos ou constitucionais.

Em alguns casos, os biomarcadores de exposição podem não ser viáveis ​​(por exemplo, para produtos químicos de vida curta in vivo). Outros produtos químicos podem ser armazenados ou afetar órgãos que não podem ser acessados ​​por procedimentos de rotina, como o sistema nervoso. A via de exposição também pode afetar o padrão de distribuição e, portanto, também a medição do biomarcador e sua interpretação. Por exemplo, a exposição direta do cérebro através do nervo olfativo provavelmente escapará da detecção pela medição dos biomarcadores de exposição. Quanto aos biomarcadores de efeito, muitos deles não são nada específicos, e a alteração pode ser devida a uma variedade de causas, incluindo fatores de estilo de vida. Talvez em particular com os biomarcadores de suscetibilidade, a interpretação deva ser muito cautelosa no momento, pois muitas incertezas permanecem sobre o significado geral de saúde de genótipos individuais.

Na saúde ocupacional, o biomarcador ideal deve atender a vários requisitos. Em primeiro lugar, a coleta e análise de amostras devem ser simples e confiáveis. Para uma qualidade analítica ideal, a padronização é necessária, mas os requisitos específicos variam consideravelmente. As principais áreas de preocupação incluem: preparação do indivíduo, procedimento de amostragem e manuseio da amostra e procedimento de medição; o último abrange fatores técnicos, como calibração e procedimentos de garantia de qualidade, e fatores relacionados ao indivíduo, como educação e treinamento de operadores.

Para documentação de validade analítica e rastreabilidade, os materiais de referência devem ser baseados em matrizes relevantes e com concentrações apropriadas de substâncias tóxicas ou metabólitos relevantes em níveis apropriados. Para que os biomarcadores sejam usados ​​para monitoramento biológico ou para fins diagnósticos, os laboratórios responsáveis ​​devem ter procedimentos analíticos bem documentados com características de desempenho definidas e registros acessíveis para permitir a verificação dos resultados. Ao mesmo tempo, no entanto, a economia de caracterizar e usar materiais de referência para complementar os procedimentos de garantia de qualidade em geral deve ser considerada. Assim, a qualidade alcançável dos resultados e os usos a que eles são destinados devem ser equilibrados com os custos adicionais de garantia de qualidade, incluindo materiais de referência, mão de obra e instrumentação.

Outra exigência é que o biomarcador seja específico, pelo menos nas circunstâncias do estudo, para um determinado tipo de exposição, com uma relação clara com o grau de exposição. Caso contrário, o resultado da medição do biomarcador pode ser muito difícil de interpretar. Para uma interpretação adequada do resultado da medição de um biomarcador de exposição, a validade diagnóstica deve ser conhecida (ou seja, a tradução do valor do biomarcador na magnitude de possíveis riscos à saúde). Nesta área, os metais servem de paradigma para a pesquisa de biomarcadores. Pesquisas recentes demonstraram a complexidade e sutileza das relações dose-resposta, com dificuldade considerável em identificar níveis sem efeito e, portanto, também em definir exposições toleráveis. No entanto, esse tipo de pesquisa também ilustrou os tipos de investigação e o refinamento necessários para descobrir as informações relevantes. Para a maioria dos compostos orgânicos, ainda não estão disponíveis associações quantitativas entre as exposições e os correspondentes efeitos adversos à saúde; em muitos casos, mesmo os órgãos-alvo primários não são conhecidos com certeza. Além disso, a avaliação dos dados de toxicidade e concentrações de biomarcadores é muitas vezes complicada pela exposição a misturas de substâncias, em vez da exposição a um único composto no momento.

Antes que o biomarcador seja aplicado para fins de saúde ocupacional, algumas considerações adicionais são necessárias. Primeiro, o biomarcador deve refletir apenas uma alteração subclínica e reversível. Em segundo lugar, dado que os resultados dos biomarcadores podem ser interpretados em relação aos riscos à saúde, esforços preventivos devem estar disponíveis e devem ser considerados realistas caso os dados dos biomarcadores sugiram a necessidade de reduzir a exposição. Em terceiro lugar, o uso prático do biomarcador deve ser geralmente considerado eticamente aceitável.

As medições de higiene industrial podem ser comparadas com os limites de exposição aplicáveis. Da mesma forma, os resultados em biomarcadores de exposição ou biomarcadores de efeito podem ser comparados aos limites de ação biológica, às vezes referidos como índices de exposição biológica. Esses limites devem ser baseados no melhor conselho de médicos e cientistas de disciplinas apropriadas, e os administradores responsáveis ​​como “gerentes de risco” devem levar em consideração os fatores éticos, sociais, culturais e econômicos relevantes. A base científica deve, se possível, incluir relações dose-resposta complementadas por informações sobre variações na suscetibilidade dentro da população em risco. Em alguns países, trabalhadores e membros do público em geral estão envolvidos no processo de estabelecimento de padrões e fornecem contribuições importantes, especialmente quando a incerteza científica é considerável. Uma das maiores incertezas é como definir um efeito adverso à saúde que deve ser evitado - por exemplo, se a formação de aduto como um biomarcador de exposição por si só representa um efeito adverso (ou seja, biomarcador de efeito) que deve ser evitado. É provável que surjam questões difíceis ao decidir se é eticamente defensável, para o mesmo composto, ter limites diferentes para exposição acidental, por um lado, e exposição ocupacional, por outro.

As informações geradas pelo uso de biomarcadores geralmente devem ser transmitidas aos indivíduos examinados na relação médico-paciente. As preocupações éticas devem ser consideradas em particular em relação a análises de biomarcadores altamente experimentais que atualmente não podem ser interpretadas em detalhes em termos de riscos reais à saúde. Para a população em geral, por exemplo, existe orientação limitada no momento com relação à interpretação de biomarcadores de exposição além da concentração de chumbo no sangue. Também é importante a confiança nos dados gerados (ou seja, se a amostragem apropriada foi realizada e se procedimentos sólidos de garantia de qualidade foram utilizados no laboratório envolvido). Uma área adicional de preocupação especial está relacionada à hipersuscetibilidade individual. Essas questões devem ser levadas em consideração ao fornecer o feedback do estudo.

Todos os setores da sociedade afetados ou preocupados com a realização de um estudo de biomarcadores precisam ser envolvidos no processo de tomada de decisão sobre como lidar com as informações geradas pelo estudo. Procedimentos específicos para prevenir ou superar conflitos éticos inevitáveis ​​devem ser desenvolvidos dentro dos marcos legais e sociais da região ou país. No entanto, cada situação representa um conjunto diferente de questões e armadilhas, e nenhum procedimento único para envolvimento do público pode ser desenvolvido para cobrir todas as aplicações de biomarcadores de exposição.

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A avaliação da toxicidade genética é a avaliação dos agentes quanto à sua capacidade de induzir qualquer um dos três tipos gerais de alterações (mutações) no material genético (DNA): gene, cromossômico e genômico. Em organismos como os humanos, os genes são compostos de DNA, que consiste em unidades individuais chamadas bases de nucleotídeos. Os genes são arranjados em estruturas físicas discretas chamadas cromossomos. A genotoxicidade pode resultar em efeitos significativos e irreversíveis na saúde humana. O dano genotóxico é um passo crítico na indução do câncer e também pode estar envolvido na indução de defeitos congênitos e morte fetal. As três classes de mutações mencionadas acima podem ocorrer dentro de qualquer um dos dois tipos de tecidos possuídos por organismos como os humanos: esperma ou óvulos (células germinativas) e o tecido remanescente (células somáticas).

Os ensaios que medem a mutação genética são aqueles que detectam a substituição, adição ou deleção de nucleotídeos dentro de um gene. Os ensaios que medem a mutação cromossômica são aqueles que detectam quebras ou rearranjos cromossômicos envolvendo um ou mais cromossomos. Os ensaios que medem a mutação genômica são aqueles que detectam alterações no número de cromossomos, uma condição chamada aneuploidia. A avaliação da toxicidade genética mudou consideravelmente desde o desenvolvimento por Herman Muller em 1927 do primeiro ensaio para detectar agentes genotóxicos (mutagênicos). Desde então, foram desenvolvidos mais de 200 ensaios que medem mutações no DNA; no entanto, menos de dez ensaios são comumente usados ​​atualmente para avaliação de toxicidade genética. Este artigo analisa esses ensaios, descreve o que eles medem e explora o papel desses ensaios na avaliação de toxicidade.

Identificação de Riscos de Câncer Antes do Desenvolvimento do Campo da Toxicologia Genética

A toxicologia genética tornou-se parte integrante do processo geral de avaliação de risco e ganhou estatura nos últimos tempos como um preditor confiável para atividade carcinogênica. No entanto, antes do desenvolvimento da toxicologia genética (antes de 1970), outros métodos foram e ainda estão sendo usados ​​para identificar riscos potenciais de câncer para os seres humanos. Existem seis categorias principais de métodos atualmente usados ​​para identificar riscos de câncer humano: estudos epidemiológicos, bioensaios in vivo de longo prazo, bioensaios in vivo de médio prazo, bioensaios in vivo e in vitro de curto prazo, inteligência artificial (estrutura-atividade), e inferência baseada em mecanismo.

A Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens desses métodos.

Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos métodos atuais para identificar riscos de câncer humano

Justificativa e Base Conceitual para Ensaios de Toxicologia Genética

Embora os tipos e números exatos de ensaios usados ​​para avaliação de toxicidade genética estejam em constante evolução e variem de país para país, os mais comuns incluem ensaios para (1) mutação genética em bactérias e/ou células de mamíferos cultivadas e (2) mutação cromossômica em células de mamíferos cultivadas e/ou medula óssea em camundongos vivos. Alguns dos ensaios dentro desta segunda categoria também podem detectar aneuploidia. Embora esses ensaios não detectem mutações em células germinativas, eles são usados ​​principalmente devido ao custo extra e à complexidade da realização de ensaios de células germinativas. No entanto, ensaios de células germinativas em camundongos são usados ​​quando informações sobre os efeitos das células germinativas são desejadas.

Estudos sistemáticos durante um período de 25 anos (1970-1995), especialmente no Programa Nacional de Toxicologia dos EUA na Carolina do Norte, resultaram no uso de um número discreto de ensaios para detectar a atividade mutagênica dos agentes. A justificativa para avaliar a utilidade dos ensaios foi baseada em sua capacidade de detectar agentes que causam câncer em roedores e que são suspeitos de causar câncer em humanos (ou seja, carcinógenos). Isso ocorre porque estudos durante as últimas décadas indicaram que as células cancerígenas contêm mutações em certos genes e que muitos carcinógenos também são mutagênicos. Assim, as células cancerígenas são vistas como contendo mutações de células somáticas, e a carcinogênese é vista como um tipo de mutagênese de células somáticas.

Os ensaios de toxicidade genética usados ​​mais comumente hoje foram selecionados não apenas por causa de seu grande banco de dados, custo relativamente baixo e facilidade de desempenho, mas porque demonstraram detectar muitos carcinógenos de roedores e, presumivelmente, humanos. Consequentemente, os ensaios de toxicidade genética são usados ​​para prever a potencial carcinogenicidade dos agentes.

Um importante desenvolvimento conceitual e prático no campo da toxicologia genética foi o reconhecimento de que muitos carcinógenos foram modificados por enzimas dentro do corpo, criando formas alteradas (metabólitos) que frequentemente eram a forma carcinogênica e mutagênica definitiva do produto químico original. Para duplicar esse metabolismo em uma placa de Petri, Heinrich Malling mostrou que a inclusão de uma preparação de fígado de roedor continha muitas das enzimas necessárias para realizar essa conversão ou ativação metabólica. Assim, muitos ensaios de toxicidade genética realizados em placas ou tubos (in vitro) empregam a adição de preparações enzimáticas semelhantes. As preparações simples são chamadas de mistura S9 e as preparações purificadas são chamadas de microssomos. Algumas células bacterianas e de mamíferos já foram geneticamente modificadas para conter alguns dos genes de roedores ou humanos que produzem essas enzimas, reduzindo a necessidade de adicionar mistura S9 ou microssomos.

Ensaios e Técnicas de Toxicologia Genética

Os sistemas bacterianos primários usados ​​para triagem de toxicidade genética são o ensaio de mutagenicidade de Salmonella (Ames) e, em uma extensão muito menor, a cepa WP2 de Escherichia coli. Estudos em meados da década de 1980 indicaram que o uso de apenas duas cepas do sistema Salmonella (TA98 e TA100) eram suficientes para detectar aproximadamente 90% dos mutagênicos conhecidos de Salmonella. Assim, essas duas cepas são usadas para a maioria dos propósitos de triagem; no entanto, várias outras cepas estão disponíveis para testes mais extensos.

Esses ensaios são realizados de várias maneiras, mas dois procedimentos gerais são os ensaios de incorporação em placa e suspensão líquida. No ensaio de incorporação de placa, as células, o produto químico de teste e (quando desejado) o S9 são adicionados juntos em um ágar liquefeito e despejados na superfície de uma placa de Petri de ágar. O ágar superior endurece em alguns minutos e as placas são incubadas por dois a três dias, após o que as células mutantes cresceram para formar aglomerados visualmente detectáveis ​​de células chamadas colônias, que são então contadas. O meio de ágar contém agentes seletivos ou é composto de ingredientes de forma que apenas as células recém-mutadas irão crescer. O ensaio de incubação líquida é semelhante, exceto que as células, agente de teste e S9 são incubados juntos em líquido que não contém ágar liquefeito e, em seguida, as células são lavadas para remover o agente de teste e S9 e semeadas no ágar.

Mutações em células de mamíferos cultivadas são detectadas principalmente em um dos dois genes: hprt e tk. Semelhante aos ensaios bacterianos, as linhagens de células de mamíferos (desenvolvidas a partir de roedores ou células humanas) são expostas ao agente de teste em placas de cultura de plástico ou tubos e, em seguida, são semeadas em placas de cultura que contêm meio com um agente seletivo que permite apenas o crescimento de células mutantes . Os ensaios usados ​​para esse fim incluem o CHO/HPRT, o TK6 e o ​​linfoma de camundongo L5178Y/TK^+/- ensaios. Outras linhas de células contendo várias mutações de reparo de DNA, bem como contendo alguns genes humanos envolvidos no metabolismo também são usadas. Esses sistemas permitem a recuperação de mutações dentro do gene (mutação gênica), bem como mutações envolvendo regiões do cromossomo que flanqueiam o gene (mutação cromossômica). No entanto, este último tipo de mutação é recuperado em muito maior extensão pelo tk sistemas de genes do que pelos hprt sistemas de genes devido à localização do tk desconfortável.

Semelhante ao ensaio de incubação líquida para mutagenicidade bacteriana, os ensaios de mutagenicidade de células de mamíferos geralmente envolvem a exposição das células em placas ou tubos de cultura na presença do agente de teste e S9 por várias horas. As células são então lavadas, cultivadas por mais alguns dias para permitir que os produtos gênicos normais (tipo selvagem) sejam degradados e os produtos gênicos recém-mutados sejam expressos e acumulados, e então eles são semeados em meio contendo um agente seletivo que permite apenas as células mutantes para crescer. Como os ensaios bacterianos, as células mutantes crescem em colônias visualmente detectáveis ​​que são então contadas.

A mutação cromossômica é identificada principalmente por ensaios citogenéticos, que envolvem a exposição de roedores e/ou roedores ou células humanas em placas de cultura a um produto químico de teste, permitindo que uma ou mais divisões celulares ocorram, coloração dos cromossomos e, em seguida, exame visual dos cromossomos através de um microscópio para detectar alterações na estrutura ou no número de cromossomos. Embora uma variedade de parâmetros possa ser examinada, os dois que são atualmente aceitos pelas agências reguladoras como sendo os mais significativos são as aberrações cromossômicas e uma subcategoria chamada micronúcleos.

São necessários treinamento e experiência consideráveis ​​para pontuar as células quanto à presença de aberrações cromossômicas, o que torna esse procedimento caro em termos de tempo e dinheiro. Em contraste, os micronúcleos requerem pouco treinamento e sua detecção pode ser automatizada. Os micronúcleos aparecem como pequenos pontos dentro da célula que são distintos do núcleo, que contém os cromossomos. Os micronúcleos resultam de quebra cromossômica ou de aneuploidia. Devido à facilidade de marcar micronúcleos em comparação com aberrações cromossômicas, e porque estudos recentes indicam que os agentes que induzem aberrações cromossômicas na medula óssea de camundongos vivos geralmente induzem micronúcleos neste tecido, os micronúcleos são agora comumente medidos como uma indicação da capacidade de um agente para induzir mutação cromossômica.

Embora os ensaios de células germinativas sejam usados ​​com muito menos frequência do que os outros ensaios descritos acima, eles são indispensáveis ​​para determinar se um agente representa um risco para as células germinativas, cujas mutações podem levar a efeitos na saúde nas gerações seguintes. Os ensaios de células germinativas mais comumente usados ​​são em camundongos e envolvem sistemas que detectam (1) translocações hereditárias (trocas) entre cromossomos (ensaio de translocação hereditária), (2) genes ou mutações cromossômicas envolvendo genes específicos (visíveis ou bioquímicas de locus específico ensaios) e (3) mutações que afetam a viabilidade (ensaio letal dominante). Tal como acontece com os ensaios de células somáticas, a suposição de trabalho com os ensaios de células germinativas é que os agentes positivos nesses ensaios são presumivelmente mutagênicos em células germinativas humanas.

Situação Atual e Perspectivas Futuras

Estudos recentes indicaram que apenas três informações eram necessárias para detectar aproximadamente 90% de um conjunto de 41 carcinógenos de roedores (ou seja, presumíveis carcinógenos humanos e mutagênicos de células somáticas). Estes incluíram (1) conhecimento da estrutura química do agente, especialmente se ele contiver porções eletrofílicas (consulte a seção sobre relações estrutura-atividade); (2) Dados de mutagenicidade de Salmonella; e (3) dados de um ensaio de toxicidade crônica de 90 dias em roedores (camundongos e ratos). De fato, praticamente todos os carcinógenos humanos declarados pela IARC são detectáveis ​​como mutagênicos usando apenas o ensaio de Salmonella e o ensaio de micronúcleo de medula óssea de camundongo. O uso desses ensaios de mutagenicidade para detectar potenciais carcinógenos humanos é apoiado ainda mais pela constatação de que a maioria dos carcinógenos humanos são carcinógenos em ratos e camundongos (carcinógenos transespécies) e que a maioria dos carcinógenos transespécies são mutagênicos em Salmonella e/ou induzem micronúcleos na medula óssea de camundongos.

Com os avanços na tecnologia do DNA, o projeto do genoma humano e uma melhor compreensão do papel da mutação no câncer, estão sendo desenvolvidos novos ensaios de genotoxicidade que provavelmente serão incorporados aos procedimentos de triagem padrão. Entre eles estão o uso de células transgênicas e roedores. Sistemas transgênicos são aqueles em que um gene de outra espécie foi introduzido em uma célula ou organismo. Por exemplo, já estão em uso experimental camundongos transgênicos que permitem a detecção de mutação em qualquer órgão ou tecido do animal, a partir da introdução de um gene bacteriano no camundongo. Células bacterianas, como Salmonella, e células de mamíferos (incluindo linhagens celulares humanas) já estão disponíveis contendo genes envolvidos no metabolismo de agentes carcinogênicos/mutagênicos, como os genes P450. Análise molecular das mutações reais induzidas no gene trans em roedores transgênicos ou em genes nativos, como hprt, ou os genes-alvo dentro da Salmonella podem agora ser realizados, de modo que a natureza exata das mutações induzidas pelos produtos químicos possa ser determinada, fornecendo informações sobre o mecanismo de ação do produto químico e permitindo comparações com mutações em humanos presumivelmente expostos ao agente .

Avanços moleculares em citogenética agora permitem uma avaliação mais detalhada de mutações cromossômicas. Isso inclui o uso de sondas (pequenos pedaços de DNA) que se ligam (hibridizam) a genes específicos. Rearranjos de genes no cromossomo podem então ser revelados pela localização alterada das sondas, que são fluorescentes e facilmente visualizadas como setores coloridos nos cromossomos. O ensaio de eletroforese em gel de célula única para quebra de DNA (comumente chamado de ensaio “cometa”) permite a detecção de quebras de DNA dentro de células individuais e pode se tornar uma ferramenta extremamente útil em combinação com técnicas citogenéticas para detectar danos cromossômicos.

Após muitos anos de uso e a geração de um banco de dados grande e sistematicamente desenvolvido, a avaliação da toxicidade genética pode agora ser feita com apenas alguns ensaios por um custo relativamente pequeno em um curto período de tempo (algumas semanas). Os dados produzidos podem ser usados ​​para prever a capacidade de um agente ser um roedor e, presumivelmente, carcinógeno humano/mutagênico de células somáticas. Esta capacidade permite limitar a introdução no ambiente de agentes mutagénicos e cancerígenos e desenvolver agentes alternativos não mutagénicos. Estudos futuros devem levar a métodos ainda melhores com maior previsibilidade do que os ensaios atuais.

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