Токсикологија игра главну улогу у развоју прописа и других политика здравља на раду. Да би се спречиле повреде и болести на раду, одлуке се све више заснивају на информацијама које се могу добити пре или у одсуству врста изложености људи које би дале дефинитивне информације о ризику, као што су епидемиолошке студије. Поред тога, токсиколошке студије, као што је описано у овом поглављу, могу пружити прецизне информације о дози и одговору под контролисаним условима лабораторијског истраживања; ове информације је често тешко добити у неконтролисаном окружењу професионалне изложености. Међутим, ове информације морају бити пажљиво процењене како би се проценила вероватноћа нежељених ефеката код људи, природа ових штетних ефеката и квантитативни однос између изложености и ефеката.

Значајна пажња посвећена је у многим земљама, од 1980-их, развоју објективних метода за коришћење токсиколошких информација у доношењу регулаторних одлука. Формалне методе, које се често називају Процена ризика, су у овим земљама предложили и користили и владини и невладини субјекти. Процена ризика је различито дефинисана; у основи, то је процес евалуације који укључује токсикологију, епидемиологију и информације о изложености како би се идентификовала и проценила вероватноћа штетних ефеката повезаних са излагањем опасним супстанцама или условима. Процена ризика може бити квалитативна по природи, указујући на природу штетног ефекта и општу процену вероватноће, или може бити квантитативна, са проценама броја погођених особа на специфичним нивоима изложености. У многим регулаторним системима, процена ризика се спроводи у четири фазе: Опасност идентификација, опис природе токсичног ефекта; евалуација доза-одговор, полуквантитативна или квантитативна анализа односа између изложености (или дозе) и тежине или вероватноће токсичног ефекта; процена изложености, евалуација информација о опсегу изложености које ће се вероватно појавити за популације уопште или за подгрупе унутар популације; карактеризација ризика, компилација свих горе наведених информација у израз величине ризика који се очекује да ће се појавити под одређеним условима изложености (види НРЦ 1983 за изјаву ових принципа).

У овом делу, три приступа процени ризика су представљена као илустративна. Немогуће је обезбедити свеобухватан списак метода за процену ризика који се користе широм света, а ови избори не би требало да се узимају као прескриптивни. Треба напоменути да постоје трендови ка хармонизацији метода процене ризика, делимично као одговор на одредбе недавних ГАТТ споразума. Тренутно су у току два процеса међународног усклађивања метода процене ризика, кроз Међународни програм за хемијску безбедност (ИПЦС) и Организацију за економску сарадњу и развој (ОЕЦД). Ове организације такође одржавају актуелне информације о националним приступима процени ризика.

Назад

Анализа односа структуре и активности (САР) је коришћење информација о молекуларној структури хемикалија за предвиђање важних карактеристика које се односе на постојаност, дистрибуцију, упијање и апсорпцију и токсичност. САР је алтернативни метод идентификације потенцијално опасних хемикалија, који обећава да ће помоћи индустријама и владама у одређивању приоритета супстанци за даљу процену или за доношење одлука у раној фази за нове хемикалије. Токсикологија је све скупљи подухват који захтева ресурсе. Повећана забринутост због потенцијала хемикалија да изазову штетне ефекте на изложену људску популацију подстакла је регулаторне и здравствене агенције да прошире опсег и осетљивост тестова за откривање токсиколошких опасности. У исто време, стварни и уочени терети регулативе за индустрију изазвали су забринутост за практичност метода испитивања токсичности и анализе података. Тренутно, одређивање хемијске канцерогености зависи од доживотног тестирања најмање две врсте, оба пола, у неколико доза, уз пажљиву хистопатолошко анализу више органа, као и детекцију пренеопластичних промена у ћелијама и циљним органима. Процењује се да у Сједињеним Државама биолошки тест рака кошта више од 3 милиона долара (1995 долара).

Чак и са неограниченим финансијским средствима, терет тестирања око 70,000 постојећих хемикалија које се данас производе у свету премашио би расположиве ресурсе обучених токсиколога. Били би потребни векови да се заврши чак и прва процена ових хемикалија (НРЦ 1984). У многим земљама етичка забринутост због употребе животиња у тестирању токсичности је порасла, што је довело до додатног притиска на употребу стандардних метода испитивања токсичности. САР се широко користи у фармацеутској индустрији за идентификацију молекула са потенцијалом за корисну употребу у лечењу (Хансцх и Зханг 1993). У политици заштите животне средине и здравља на раду, САР се користи за предвиђање дисперзије једињења у физичко-хемијском окружењу и за скрининг нових хемикалија за даљу процену потенцијалне токсичности. Према америчком Закону о контроли токсичних супстанци (ТСЦА), ЕПА је од 1979. користила САР приступ као „први екран“ нових хемикалија у процесу обавештавања о препроизводњи (ПМН); Аустралија користи сличан приступ као део своје нове процедуре обавештавања о хемикалијама (НИЦНАС). У америчкој САР анализи је важна основа за утврђивање да постоји разумна основа да се закључи да ће производња, прерада, дистрибуција, употреба или одлагање супстанце представљати неразуман ризик од повреде здравља људи или животне средине, као што се захтева у Одељку 5(ф) ТСЦА. На основу овог налаза, ЕПА онда може да захтева стварна испитивања супстанце у складу са Одељком 6 ТСЦА.

Образложење за САР

Научно образложење за САР заснива се на претпоставци да ће молекуларна структура хемикалије предвидети важне аспекте њеног понашања у физичко-хемијским и биолошким системима (Хансцх и Лео 1979).

САР процес

Процес САР прегледа укључује идентификацију хемијске структуре, укључујући емпиријске формулације, као и чисто једињење; идентификација структурно аналогних супстанци; претраживање база података и литературе за информације о структурним аналозима; и анализу токсичности и других података о структурним аналозима. У неким ретким случајевима, сама информација о структури једињења може бити довољна да подржи неку САР анализу, засновану на добро схваћеним механизмима токсичности. Састављено је неколико база података о САР-у, као и компјутерски засноване методе за предвиђање молекуларне структуре.

Са овим информацијама, следеће крајње тачке се могу проценити помоћу САР-а:

• физичко-хемијски параметри: тачка кључања, притисак паре, растворљивост у води, коефицијент расподеле октанол/вода
• биолошки/еколошки параметри судбине: биоразградња, сорпција тла, фотодеградација, фармакокинетика
• параметри токсичности: токсичност за водене организме, апсорпција, акутна токсичност за сисаре (гранични тест или ЛД₅₀), иритација коже, плућа и очију, сензибилизација, субхронична токсичност, мутагеност.

Треба напоменути да САР методе не постоје за тако важне здравствене крајње тачке као што су карциногеност, развојна токсичност, репродуктивна токсичност, неуротоксичност, имунотоксичност или други ефекти на циљне органе. Ово је због три фактора: непостојања велике базе података на основу које би се тестирале хипотезе САР, недостатка знања о структурним детерминантама токсичног деловања и мноштва циљних ћелија и механизама који су укључени у ове крајње тачке (погледајте „Сједињене Државе приступ процени ризика од репродуктивних токсиканата и неуротоксичних агенаса”). Неки ограничени покушаји да се користи САР за предвиђање фармакокинетике коришћењем информација о коефицијентима поделе и растворљивости (Јохансон и Наслунд 1988). Екстензивнији квантитативни САР је урађен да би се предвидео П450 зависан метаболизам низа једињења и везивање молекула сличних диоксину и ПЦБ-у за цитосолни „диоксински“ рецептор (Хансцх и Зханг 1993).

Показало се да САР има различиту предвидљивост за неке од горе наведених крајњих тачака, као што је приказано у табели 1. Ова табела представља податке из два поређења предвиђене активности са стварним резултатима добијеним емпиријским мерењем или тестирањем токсичности. САР, како су га спровели стручњаци америчке ЕПА, има лошије резултате у предвиђању физичко-хемијских својстава него у предвиђању биолошке активности, укључујући биоразградњу. За крајње тачке токсичности, САР је био најбољи за предвиђање мутагености. Асхби и Теннант (1991) су у проширеној студији такође пронашли добру предвидљивост краткорочне генотоксичности у својој анализи НТП хемикалија. Ови налази нису изненађујући, имајући у виду тренутно разумевање молекуларних механизама генотоксичности (видети „Генетичка токсикологија”) и улоге електрофилности у везивању ДНК. Насупрот томе, САР је имао тенденцију да не предвиди системску и субхроничну токсичност код сисара и претерано предвиди акутну токсичност за водене организме.

Табела 1. Поређење САР и тест података: ОЕЦД/НТП анализе

Извор: Подаци из ОЕЦД-а, лична комуникација Ц. Ауер, УС ЕПА. У овој анализи коришћене су само оне крајње тачке за које су била доступна упоредива предвиђања САР-а и стварни подаци теста. НТП подаци су од Ешбија и Тенанта 1991.

¹ Забрињавајући је неуспех САР-а да предвиди акутну токсичност у 12% тестираних хемикалија.

² Подаци ОЕЦД-а, засновани на усклађености Амесовог теста са САР

³ НТП подаци, засновани на тестовима генетских токсина у поређењу са предвиђањима САР-а за неколико класа „хемикалија које упозоравају на структуру“.

⁴ Усклађеност варира у зависности од класе; највећа подударност је била са ароматичним амино/нитро једињењима; најниже са „разним“ структурама.

За друге токсичне крајње тачке, као што је горе наведено, САР има мање видљиву корист. Предвиђања токсичности код сисара су компликована недостатком САР-а за токсикокинетику сложених молекула. Ипак, направљени су неки покушаји да се предложе САР принципи за комплексне крајње тачке токсичности код сисара (на пример, видети Бернстеин (1984) за САР анализу потенцијалних репродуктивних токсиканата за мушкарце). У већини случајева, база података је премала да би омогућила ригорозно тестирање предвиђања заснованих на структури.

У овом тренутку може се закључити да САР може бити користан углавном за одређивање приоритета улагања ресурса за испитивање токсичности или за рану забринутост о потенцијалној опасности. Само у случају мутагености је вероватно да се САР анализа сама по себи може поуздано користити за доношење других одлука. Ни за једну крајњу тачку није вероватно да САР може да обезбеди врсту квантитативних информација потребних за потребе процене ризика као што је дискутовано на другом месту у овом поглављу и Енциклопедија.

Назад

Појава софистицираних технологија у молекуларној и ћелијској биологији подстакла је релативно брзу еволуцију у наукама о животу, укључујући токсикологију. У ствари, фокус токсикологије се помера са целих животиња и популације целих животиња на ћелије и молекуле појединачних животиња и људи. Од средине 1980-их, токсиколози су почели да користе ове нове методологије у процени ефеката хемикалија на живе системе. Као логичан напредак, такве методе се прилагођавају за потребе испитивања токсичности. Ова научна достигнућа су радила заједно са друштвеним и економским факторима како би утицала на промену у процени безбедности производа и потенцијалног ризика.

Економски фактори су посебно повезани са запремином материјала који се мора тестирати. Сваке године на тржиште се уводи мноштво нових козметичких, фармацеутских, пестицида, хемикалија и производа за домаћинство. Сви ови производи морају бити процењени на њихову потенцијалну токсичност. Поред тога, постоји заостатак хемикалија које су већ у употреби које нису адекватно тестиране. Огроман задатак добијања детаљних безбедносних информација о свим овим хемикалијама коришћењем традиционалних метода испитивања целих животиња био би скуп и у смислу новца и времена, ако би уопште могао да се оствари.

Постоје и друштвена питања која се односе на јавно здравље и безбедност, као и све већа забринутост јавности у вези са употребом животиња за тестирање безбедности производа. Што се тиче безбедности људи, групе за јавни интерес и заштиту животне средине извршиле су значајан притисак на владине агенције да примењују строже прописе о хемикалијама. Недавни пример овога је покрет неких еколошких група за забрану хлора и једињења која садрже хлор у Сједињеним Државама. Једна од мотивација за тако екстремну акцију лежи у чињеници да већина ових једињења никада није била адекватно испитана. Из токсиколошке перспективе, концепт забране читаве класе различитих хемикалија заснованих само на присуству хлора је и научно неисправан и неодговоран. Ипак, разумљиво је да из перспективе јавности мора постојати извесна гаранција да хемикалије које се испуштају у животну средину не представљају значајан ризик по здравље. Таква ситуација наглашава потребу за ефикаснијим и бржим методама за процену токсичности.

Друга друштвена брига која је утицала на област испитивања токсичности је добробит животиња. Све већи број група за заштиту животиња широм света изразио је значајно противљење употреби целих животиња за тестирање безбедности производа. Активне кампање вођене су против произвођача козметике, производа за домаћинство и личну негу и фармацеутских производа у покушају да се зауставе тестирање на животињама. Такви напори у Европи су резултирали усвајањем Шестог амандмана на Директиву 76/768/ЕЕЦ (Директива о козметици). Последица ове Директиве је да се козметички производи или козметички састојци који су тестирани на животињама после 1. јануара 1998. године не могу пласирати на тржиште Европске уније, осим ако алтернативне методе нису довољно валидиране. Иако ова Директива нема надлежност над продајом таквих производа у Сједињеним Државама или другим земљама, она ће значајно утицати на компаније које имају међународна тржишта која укључују Европу.

Концепт алтернатива, који чини основу за развој тестова, осим оних на целим животињама, дефинисан је са три Rs: Смањење у броју коришћених животиња; пречишћавање протокола тако да животиње доживљавају мање стреса или нелагодности; и замена актуелних тестова на животињама са ин витро тестовима (тј. тестовима који се раде ван живих животиња), компјутерским моделима или тестовима на нижим врстама кичмењака или бескичмењака. Три Rсу представљени у књизи коју су 1959. објавила два британска научника, ВМС Русселл и Рек Бурцх, Принципи хумане експерименталне технике. Расел и Бурч су сматрали да је једини начин на који се могу добити валидни научни резултати кроз хуман третман према животињама и веровали су да треба развити методе како би се смањила употреба животиња и на крају је заменила. Занимљиво је да су принципи које су изнели Расел и Бурч добили мало пажње све до поновног оживљавања покрета за добробит животиња средином 1970-их. Данас концепт троје Rс је веома у првом плану у погледу истраживања, тестирања и образовања.

Укратко, на развој методологија ин витро тестирања утицали су различити фактори који су се приближили током последњих десет до 20 година. Тешко је утврдити да ли би било који од ових фактора сам по себи имао тако дубок утицај на стратегије испитивања токсичности.

Концепт ин витро тестова токсичности

Овај одељак ће се фокусирати искључиво на ин витро методе за процену токсичности, као једну од алтернатива тестирању на целим животињама. Додатне не-животињске алтернативе, као што су компјутерско моделирање и квантитативни односи структуре и активности, разматрају се у другим чланцима овог поглавља.

Ин витро студије се генерално спроводе на животињским или људским ћелијама или ткивима ван тела. Ин витро буквално значи „у стаклу“ и односи се на поступке који се спроводе на живом материјалу или компонентама живог материјала узгајаног у петријевим посудама или у епруветама под дефинисаним условима. Ово се може супротставити студијама ин виво или онима које су спроведене „на живим животињама“. Иако је тешко, ако не и немогуће, пројектовати ефекте хемикалије на сложени организам када су посматрања ограничена на једну врсту ћелија у посуди, ин витро студије такође пружају значајну количину информација о интринзичној токсичности. као ћелијски и молекуларни механизми токсичности. Поред тога, оне нуде многе предности у односу на ин виво студије у томе што су генерално јефтиније и могу се спроводити под више контролисаним условима. Штавише, упркос чињеници да је још увек потребан мали број животиња за добијање ћелија за ин витро културе, ове методе се могу сматрати алтернативама редукције (пошто се користи много мање животиња у поређењу са ин виво студијама) и алтернативама за пречишћавање (јер елиминишу потребу подвргавање животиња штетним токсичним последицама које намећу експерименти ин виво).

Да би се интерпретирали резултати испитивања токсичности ин витро, утврдила њихова потенцијална корисност у процени токсичности и повезали их са укупним токсиколошким процесом ин виво, неопходно је разумети који део токсиколошког процеса се испитује. Цео токсиколошки процес састоји се од догађаја који почињу излагањем организма физичком или хемијском агенсу, напредују кроз ћелијске и молекуларне интеракције и на крају се манифестују у одговору целог организма. Ин витро тестови су генерално ограничени на део токсиколошког процеса који се одвија на ћелијском и молекуларном нивоу. Типови информација које се могу добити из ин витро студија укључују путеве метаболизма, интеракцију активних метаболита са ћелијским и молекуларним циљевима и потенцијално мерљиве токсичне крајње тачке које могу послужити као молекуларни биомаркери за излагање. У идеалној ситуацији, механизам токсичности сваке хемикалије од излагања до манифестације организма био би познат, тако да би се информације добијене ин витро тестовима могле у потпуности тумачити и повезати са одговором целог организма. Међутим, то је практично немогуће, пошто је релативно мало комплетних токсиколошких механизама разјашњено. Дакле, токсиколози су суочени са ситуацијом у којој се резултати ин витро теста не могу користити као потпуно тачно предвиђање ин виво токсичности јер је механизам непознат. Међутим, често се током процеса развоја ин витро теста разјашњавају компоненте ћелијског и молекуларног механизма(а) токсичности.

Једно од кључних нерешених питања у вези са развојем и имплементацијом ин витро тестова односи се на следеће разматрање: да ли они морају бити механички засновани или је довољно да буду дескриптивни? Из научне перспективе несумњиво је боље користити само механичке тестове као замену за ин виво тестове. Међутим, у недостатку потпуног механистичког знања, изгледи за развој ин витро тестова који би у потпуности заменили тестове на животињама у блиској будућности су скоро никакви. Ово, међутим, не искључује употребу дескриптивнијих типова тестова као раних алата за скрининг, што је тренутно случај. Ови екрани су довели до значајног смањења употребе животиња. Стога, све док се не генерише више механичких информација, можда ће бити неопходно применити у ограниченој мери тестове чији резултати једноставно добро корелирају са онима добијеним ин виво.

Ин витро тестови за цитотоксичност

У овом одељку биће описано неколико ин витро тестова који су развијени за процену цитотоксичног потенцијала хемикалије. Углавном, ови тестови су лаки за извођење и анализа се може аутоматизовати. Један који се обично користи ин витро тест за цитотоксичност је неутрални црвени тест. Овај тест се ради на ћелијама у култури, а за већину примена, ћелије се могу одржавати у посудама за културу које садрже 96 малих бунара, сваки пречника 6.4 мм. Пошто сваки бунар може да се користи за једно одређивање, овај распоред може да прихвати више концентрација испитиване хемикалије, као и позитивне и негативне контроле са довољним бројем понављања за сваку. Након третмана ћелија различитим концентрацијама испитиване хемикалије у распону од најмање два реда величине (нпр. од 0.01 мМ до 1 мМ), као и хемикалијама позитивне и негативне контроле, ћелије се испиру и третирају неутралном црвеном бојом, а боја коју могу да усвоје и задрже само живе ћелије. Боја се може додати након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили непосредни ефекти, или се може додати у различито време након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили кумулативни или одложени ефекти. Интензитет боје у сваком бунарчићу одговара броју живих ћелија у том бунарчићу. Интензитет боје се мери спектрофотометром који може бити опремљен читачем плоча. Читач плоча је програмиран да обезбеди појединачна мерења за сваки од 96 бунарчића посуде за културу. Ова аутоматизована методологија дозвољава истраживачу да брзо изведе експеримент концентрације и одговора и да добије статистички корисне податке.

Још један релативно једноставан тест за цитотоксичност је МТТ тест. МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолијум бромид) је тетразолијумова боја коју митохондријски ензими редукују у плаву боју. Само ћелије са одрживим митохондријама ће задржати способност да спроведу ову реакцију; стога је интензитет боје директно повезан са степеном интегритета митохондрија. Ово је користан тест за откривање општих цитотоксичних једињења, као и оних агенаса који специфично циљају митохондрије.

Мерење активности лактат дехидрогеназе (ЛДХ) се такође користи као тест широког спектра цитотоксичности. Овај ензим је нормално присутан у цитоплазми живих ћелија и ослобађа се у медијум ћелијске културе кроз ћелијске мембране мртвих или умирућих ћелија које су биле штетно погођене токсичним агенсом. Мале количине медијума за културу могу се уклонити у различитим временима након хемијског третмана ћелија да би се измерила количина ослобођеног ЛДХ и одредио временски ток токсичности. Иако је тест ослобађања ЛДХ веома општа процена цитотоксичности, он је користан јер се лако изводи и може се урадити у реалном времену.

Постоји много нових метода које се развијају за откривање оштећења ћелија. Софистицираније методе користе флуоресцентне сонде за мерење различитих интрацелуларних параметара, као што су ослобађање калцијума и промене пХ и мембранског потенцијала. Генерално, ове сонде су веома осетљиве и могу открити суптилније ћелијске промене, чиме се смањује потреба за коришћењем ћелијске смрти као крајње тачке. Поред тога, многи од ових флуоресцентних тестова могу бити аутоматизовани коришћењем плоча са 96 јажица и читача флуоресцентних плоча.

Када се прикупе подаци о низу хемикалија помоћу једног од ових тестова, може се одредити релативна токсичност. Релативна токсичност хемикалије, утврђена ин витро тестом, може се изразити као концентрација која има 50% ефекта на одговор крајње тачке нетретираних ћелија. Ова одлука се назива ЕК₅₀ (Eефективно Cконцентрација за 50% ћелија) и може се користити за поређење токсичности различитих хемикалија ин витро. (Сличан термин који се користи у процени релативне токсичности је ИЦ₅₀, што указује на концентрацију хемикалије која изазива 50% инхибицију ћелијског процеса, нпр. способност да преузме неутрално црвено.) Није лако проценити да ли је релативна ин витро токсичност хемикалија упоредива са њиховом релативном у виво токсичности, пошто постоји толико збуњујућих фактора у систему ин виво, као што су токсикокинетика, метаболизам, поправка и одбрамбени механизми. Поред тога, пошто већина ових тестова мери опште крајње тачке цитотоксичности, они нису механички засновани. Стога је слагање између ин витро и ин виво релативне токсичности једноставно корелативно. Упркос бројним сложеностима и потешкоћама у екстраполацији са ин витро на ин виво, ови ин витро тестови су се показали веома вредним јер су једноставни и јефтини за извођење и могу се користити као екрани за означавање високо токсичних лекова или хемикалија у раним фазама развој.

Токсичност циљног органа

Ин витро тестови се такође могу користити за процену специфичне токсичности циљног органа. Постоје бројне потешкоће повезане са дизајнирањем таквих тестова, од којих је најзначајнија неспособност ин витро система да одрже многе карактеристике органа ин виво. Често, када се ћелије узму од животиња и ставе у културу, оне имају тенденцију или да брзо дегенеришу и/или да се дедиференцирају, односно изгубе своје функције сличне органу и постану генеричке. Ово представља проблем јер у кратком временском периоду, обично неколико дана, културе више нису корисне за процену ефеката токсина специфичних за органе.

Многи од ових проблема се превазилазе због недавног напретка у молекуларној и ћелијској биологији. Информације које се добију о ћелијском окружењу ин виво могу се користити за модулацију услова културе ин витро. Од средине 1980-их, откривени су нови фактори раста и цитокини, а многи од њих су сада доступни комерцијално. Додавање ових фактора ћелијама у култури помаже у очувању њиховог интегритета и такође може помоћи да се задрже више диференциране функције током дужег временског периода. Друге основне студије су повећале знање о нутритивним и хормонским потребама ћелија у култури, тако да се могу формулисати нови медији. Недавни напредак је такође постигнут у идентификацији природних и вештачких екстрацелуларних матрица на којима се ћелије могу узгајати. Култура ћелија на овим различитим матрицама може имати дубоке ефекте и на њихову структуру и на функцију. Главна предност која произилази из овог знања је способност да се замршено контролише окружење ћелија у култури и појединачно испитају ефекти ових фактора на основне ћелијске процесе и на њихове одговоре на различите хемијске агенсе. Укратко, ови системи могу пружити сјајан увид у механизме токсичности специфичне за органе.

Многе студије токсичности за циљне органе спроводе се у примарним ћелијама, које су по дефиницији свеже изоловане из органа и обично показују ограничен животни век у култури. Постоје многе предности поседовања примарних култура једног типа ћелије из органа за процену токсичности. Из механичке перспективе, такве културе су корисне за проучавање специфичних ћелијских циљева хемикалије. У неким случајевима, два или више типова ћелија из органа могу се култивисати заједно, а ово пружа додатну предност у могућности да се посматрају интеракције ћелија-ћелија као одговор на токсин. Неки системи ко-културе за кожу су конструисани тако да формирају тродимензионалну структуру која личи на кожу ин виво. Такође је могуће заједно култивисати ћелије из различитих органа — на пример, јетре и бубрега. Ова врста културе би била корисна у процени ефеката специфичних за ћелије бубрега, хемикалије која се мора биоактивирати у јетри.

Молекуларно биолошки алати су такође играли важну улогу у развоју континуираних ћелијских линија које могу бити корисне за испитивање токсичности циљних органа. Ове ћелијске линије се генеришу трансфекцијом ДНК у примарне ћелије. У поступку трансфекције, ћелије и ДНК се третирају тако да ДНК могу да преузму ћелије. ДНК је обично од вируса и садржи ген или гене који, када се експримирају, омогућавају ћелијама да постану овековечене (тј. способне да живе и расту у дужем временском периоду у култури). ДНК се такође може конструисати тако да бесмртни ген контролише индуцибилни промотер. Предност ове врсте конструкта је у томе што ће се ћелије поделити само када добију одговарајући хемијски стимуланс који омогућава експресију бесмртног гена. Пример таквог конструкта је велики ген Т антигена из Симиан вируса 40 (СВ40) (ген за бесмртност), коме претходи промоторски регион металотионеинског гена, који је индукован присуством метала у медијуму културе. Дакле, након што је ген трансфектован у ћелије, ћелије се могу третирати ниским концентрацијама цинка да би се стимулисао МТ промотор и укључила експресија гена Т антигена. У овим условима, ћелије се размножавају. Када се цинк уклони из медијума, ћелије престају да се деле и под идеалним условима се враћају у стање у коме изражавају своје функције специфичне за ткиво.

Способност стварања бесмртних ћелија у комбинацији са напретком у технологији ћелијске културе у великој мери је допринела стварању ћелијских линија из многих различитих органа, укључујући мозак, бубреге и јетру. Међутим, пре него што се ове ћелијске линије могу користити као сурогат за веродостојне типове ћелија, морају се пажљиво окарактерисати да би се утврдило колико су „нормалне“ заиста.

Други ин витро системи за проучавање токсичности циљних органа укључују све већу сложеност. Како ин витро системи напредују у сложености од једне ћелије до културе целог органа, они постају све упоредивији са ин виво миљеом, али у исто време постају много тежи за контролу с обзиром на повећан број варијабли. Стога, оно што се може добити преласком на виши ниво организације може се изгубити у неспособности истраживача да контролише експериментално окружење. Табела 1 упоређује неке од карактеристика различитих ин витро система који су коришћени за проучавање хепатотоксичности.

Табела 1. Поређење ин витро система за студије хепатотоксичности

Прецизно исечени комади ткива се више користе за токсиколошке студије. Доступни су нови инструменти који омогућавају истраживачу да сече уједначене резове ткива у стерилном окружењу. Резови ткива нуде одређену предност у односу на системе ћелијске културе јер су присутни сви типови ћелија органа и одржавају своју архитектуру ин виво и међућелијску комуникацију. Стога, ин витро студије могу да се спроведу да би се одредио тип циљне ћелије унутар органа, као и да се испита специфична токсичност за циљни орган. Недостатак резина је што се брзо дегенеришу након прва 24 сата културе, углавном због лоше дифузије кисеоника до ћелија у унутрашњости резова. Међутим, недавне студије су показале да се ефикаснија аерација може постићи благим окретањем. Ово, заједно са употребом сложенијег медијума, омогућава да кришке преживе до 96 сати.

Експлантати ткива су по концепту слични резовима ткива и такође се могу користити за одређивање токсичности хемикалија у одређеним циљним органима. Експлантати ткива се успостављају уклањањем малог комада ткива (за студије тератогености, нетакнути ембрион) и стављањем у културу ради даљег проучавања. Културе експлантата су биле корисне за краткорочне студије токсичности укључујући иритацију и корозивност коже, студије азбеста у трахеји и студије неуротоксичности у можданом ткиву.

Изоловани перфузирани органи се такође могу користити за процену токсичности циљног органа. Ови системи нуде предност сличну оној код резова ткива и експлантата у томе што су присутни сви типови ћелија, али без стреса на ткиво унетог манипулацијама укљученим у припрему резова. Поред тога, омогућавају одржавање интеракција унутар органа. Главни недостатак је њихова краткорочна одрживост, што ограничава њихову употребу за ин витро испитивање токсичности. У смислу служења као алтернатива, ове културе се могу сматрати префињеношћу јер животиње не доживљавају штетне последице ин виво третмана токсичним супстанцама. Међутим, њихова употреба не смањује значајно број потребних животиња.

Укратко, постоји неколико типова ин витро система доступних за процену токсичности циљног органа. Могуће је добити много информација о механизмима токсичности користећи једну или више ових техника. Потешкоћа остаје у знању како да се екстраполира из ин витро система, који представља релативно мали део токсиколошког процеса, на цео процес који се одвија ин виво.

Ин витро тестови за иритацију ока

Можда најспорнији тест токсичности за целе животиње из перспективе добробити животиња је Драизеов тест за иритацију очију, који се спроводи код зечева. У овом тесту, мала фиксна доза хемикалије ставља се у једно око зеца док се друго око користи као контрола. Степен иритације и упале се оцењује у различитим временима након излагања. Улажу се велики напори да се развију методологије које ће заменити овај тест, који је критикован не само из хуманих разлога, већ и због субјективности запажања и варијабилности резултата. Занимљиво је приметити да се упркос оштрим критикама које је Драизеов тест добио, показао да је изузетно успешан у предвиђању иритација људских очију, посебно благо до умерено иритирајућих супстанци, које је тешко идентификовати другим методама. Дакле, захтеви за ин витро алтернативама су велики.

Потрага за алтернативама Драизе тесту је компликована, иако се предвиђа да ће бити успешна. Бројне ин витро и друге алтернативе су развијене иу неким случајевима су спроведене. Алтернативе префињености Драизе тесту, које су по дефиницији мање болне или узнемирујуће за животиње, укључују тест малог волумена очију, у којем се мање количине тест материјала стављају у очи зечева, не само из хуманих разлога, већ и да би ближе опонашају количине којима људи могу бити случајно изложени. Још једно прецизирање је да се супстанце које имају пХ мањи од 2 или већи од 11.5 више не тестирају на животињама јер се зна да су јако иритантне за око.

Између 1980. и 1989. године, процењено је да је број зечева који се користе за тестирање козметике на иритацију очију за 87%. Ин витро тестови су укључени као део нивоа тестирања како би се дошло до овог огромног смањења у тестовима на целим животињама. Овај приступ је процес у више корака који почиње темељним испитивањем историјских података о иритацији ока и физичко-хемијском анализом хемикалије коју треба проценити. Ако ова два процеса не дају довољно информација, онда се врши батерија ин витро тестова. Додатни подаци добијени ин витро тестовима тада могу бити довољни за процену безбедности супстанце. Ако не, онда би последњи корак био извођење ограничених ин виво тестова. Лако је видети како овај приступ може елиминисати или бар драстично смањити број животиња потребних за предвиђање безбедности испитиване супстанце.

Батерија ин витро тестова која се користи као део ове стратегије нивоа тестирања зависи од потреба одређене индустрије. Тестирање иритације очију врши се у разним индустријама, од козметике преко фармацеутских производа до индустријских хемикалија. Врста информација које захтева свака индустрија варира и стога није могуће дефинисати једну батерију ин витро тестова. Тест батерија је генерално дизајнирана да процени пет параметара: цитотоксичност, промене у физиологији и биохемији ткива, квантитативни односи структуре и активности, медијатори упале и опоравак и поправка. Пример теста за цитотоксичност, који је један од могућих узрока иритације, је неутрални црвени тест који користи култивисане ћелије (види горе). Промене у ћелијској физиологији и биохемији које су резултат излагања хемикалијама могу се испитати у културама епителних ћелија рожњаче човека. Алтернативно, истраживачи су такође користили нетакнуте или сециране говеђе или пилеће очне јабучице добијене из кланица. Многе крајње тачке мерене у овим целим културама органа су исте као оне мерене ин виво, као што су замућеност рожњаче и отицање рожњаче.

Упала је често компонента хемикалије изазване повреде ока, а постоји низ тестова који су доступни за испитивање овог параметра. Различити биохемијски тестови откривају присуство медијатора који се ослобађају током инфламаторног процеса, као што су арахидонска киселина и цитокини. Хориоалантоична мембрана (ЦАМ) кокошијег јајета се такође може користити као индикатор упале. У ЦАМ тесту, мали комад љуске пилећег ембриона од десет до 14 дана се уклања да би се открио ЦАМ. Хемикалија се затим примењује на ЦАМ и знаци упале, као што је васкуларно крварење, се бележе у различитим временима након тога.

Један од најтежих ин виво процеса за процену ин витро је опоравак и поправка повреде ока. Новоразвијени инструмент, силицијумски микрофизиометар, мери мале промене у екстрацелуларном пХ и може се користити за праћење култивисаних ћелија у реалном времену. Показало се да ова анализа прилично добро корелира са ин виво опоравком и коришћена је као ин витро тест за овај процес. Ово је био кратак преглед типова тестова који се користе као алтернативе Драизе тесту за иритацију ока. Вероватно је да ће у наредних неколико година бити дефинисана комплетна серија ин витро тест батерија и свака ће бити валидирана за своју специфичну намену.

Валидација

Кључ за регулаторно прихватање и имплементацију методологија ин витро тестирања је валидација, процес којим се утврђује кредибилитет теста кандидата за одређену сврху. Напори да се дефинише и координише процес валидације учињени су иу Сједињеним Државама иу Европи. Европска унија је основала Европски центар за валидацију алтернативних метода (ЕЦВАМ) 1993. године да би координирала напоре тамо и радила у интеракцији са америчким организацијама као што је Џон Хопкинс центар за алтернативе тестирању на животињама (ЦААТ), академски центар у Сједињеним Државама. , и Међуагенцијски координациони комитет за валидацију алтернативних метода (ИЦЦВАМ), састављен од представника Националног института за здравље, Америчке агенције за заштиту животне средине, америчке Управе за храну и лекове и Комисије за безбедност потрошачких производа.

Валидација ин витро тестова захтева значајну организацију и планирање. Мора постојати консензус међу владиним регулаторима и индустријским и академским научницима о прихватљивим процедурама, као и довољан надзор од стране научног саветодавног одбора како би се осигурало да протоколи испуњавају постављене стандарде. Студије валидације треба да се изводе у низу референтних лабораторија користећи калибрисане сетове хемикалија из хемијске банке и ћелије или ткива из једног извора. И унутарлабораторијска поновљивост и међулабораторијска поновљивост теста кандидата морају се показати, а резултати подвргнути одговарајућој статистичкој анализи. Када се сакупе резултати различитих компоненти студија валидације, научни саветодавни одбор може дати препоруке о валидности тестова кандидата за одређену сврху. Поред тога, резултате студија треба објавити у рецензираним часописима и ставити у базу података.

Дефиниција процеса валидације је тренутно у току. Свака нова студија валидације ће пружити информације корисне за дизајн следеће студије. Међународна комуникација и сарадња су од суштинског значаја за брз развој широко прихватљивог низа протокола, посебно имајући у виду повећану хитност коју намеће усвајање Директиве ЕК о козметици. Ово законодавство може заиста пружити потребан подстицај за предузимање озбиљних напора за валидацију. Тек кроз завршетак овог процеса може почети прихватање ин витро метода од стране различитих регулаторних заједница.

Zakljucak

Овај чланак је пружио широк преглед тренутног статуса испитивања токсичности ин витро. Наука о ин витро токсикологији је релативно млада, али експоненцијално расте. Изазов за наредне године је да се механичко знање генерисано ћелијским и молекуларним студијама инкорпорира у огроман ин виво података како би се обезбедио потпунији опис токсиколошких механизама, као и да се успостави парадигма по којој се подаци ин витро могу користити за предвиђање токсичности ин виво. Инхерентна вредност ових ин витро метода ће бити остварена само кроз усаглашене напоре токсиколога и представника владе.

Назад

Процена генетичке токсичности је процена агенса за њихову способност да изазову било коју од три општа типа промена (мутација) у генетском материјалу (ДНК): генске, хромозомске и геномске. У организмима као што су људи, гени се састоје од ДНК, која се састоји од појединачних јединица које се зову нуклеотидне базе. Гени су распоређени у дискретне физичке структуре које се називају хромозоми. Генотоксичност може довести до значајних и неповратних ефеката на људско здравље. Генотоксично оштећење је критичан корак у индукцији рака и такође може бити укључено у индукцију урођених мана и феталне смрти. Три класе мутација које су горе поменуте могу се јавити унутар било којег од два типа ткива које поседују организми као што су људи: сперматозоида или јајашца (герминативне ћелије) и преосталог ткива (соматске ћелије).

Тестови који мере мутацију гена су они који откривају супституцију, додавање или брисање нуклеотида унутар гена. Тестови који мере хромозомску мутацију су они који откривају ломове или хромозомске преуређење које укључује један или више хромозома. Тестови који мере геномску мутацију су они који откривају промене у броју хромозома, стање које се зове анеуплоидија. Процена генетске токсичности се значајно променила од када је Херман Мулер 1927. године развио први тест за откривање генотоксичних (мутагених) агенаса. Од тада је развијено више од 200 тестова који мере мутације у ДНК; међутим, данас се обично користи мање од десет тестова за процену генетске токсичности. Овај чланак даје преглед ових тестова, описује шта они мере и истражује улогу ових тестова у процени токсичности.

Идентификација опасности од рака Пре развоја Поље генетске токсикологије

Генетска токсикологија је постала саставни део целокупног процеса процене ризика и стекла је у последње време као поуздани предиктор канцерогене активности. Међутим, пре развоја генетске токсикологије (пре 1970), друге методе су се користиле и још увек се користе за идентификацију потенцијалних опасности од рака за људе. Постоји шест главних категорија метода које се тренутно користе за идентификацију ризика од рака код људи: епидемиолошке студије, дугорочни ин виво биолошки тестови, средњорочни ин виво биолошки тестови, краткорочни ин виво и ин витро биолошки тестови, вештачка интелигенција (структура-активност), и закључивање засновано на механизму.

Табела 1 даје предности и недостатке ових метода.

Табела 1. Предности и недостаци актуелних метода за идентификацију ризика од рака код људи

Образложење и концептуална основа за генетске токсиколошке анализе

Иако се тачни типови и број тестова који се користе за процену генетске токсичности стално развијају и варирају од земље до земље, најчешћи су тестови за (1) генске мутације у бактеријама и/или култивисаним ћелијама сисара и (2) хромозомске мутације у култивисане ћелије сисара и/или коштану срж унутар живих мишева. Неки од тестова у оквиру ове друге категорије такође могу открити анеуплоидију. Иако ови тестови не откривају мутације у заметним ћелијама, они се првенствено користе због додатних трошкова и сложености извођења тестова заметних ћелија. Без обзира на то, тестови заметних ћелија код мишева се користе када су пожељне информације о ефектима заметних ћелија.

Систематске студије током периода од 25 година (1970-1995), посебно у америчком Националном токсиколошком програму у Северној Каролини, резултирале су употребом дискретног броја тестова за откривање мутагене активности агенаса. Образложење за процену корисности тестова заснивало се на њиховој способности да открију агенсе који изазивају рак код глодара и за које се сумња да изазивају рак код људи (тј. канцерогене). То је зато што су студије током последњих неколико деценија показале да ћелије рака садрже мутације у одређеним генима и да су многи карциногени такође мутагени. Према томе, ћелије рака се посматрају као оне које садрже мутације соматских ћелија, а карциногенеза се посматра као врста мутагенезе соматских ћелија.

Тестови генетске токсичности који се данас најчешће користе одабрани су не само због њихове велике базе података, релативно ниске цене и лакоће извођења, већ и због тога што се показало да откривају многе карциногене за глодаре и, претпоставља се, за људе. Сходно томе, тестови генетске токсичности се користе за предвиђање потенцијалне канцерогености агенаса.

Важан концептуални и практични развој у области генетске токсикологије било је признање да су многи карциногени модификовани ензимима унутар тела, стварајући измењене облике (метаболите) који су често били крајњи канцероген и мутагени облик матичне хемикалије. Да би поновио овај метаболизам у петријевој посуди, Хајнрих Малинг је показао да укључивање препарата из јетре глодара садржи многе ензиме неопходне за обављање ове метаболичке конверзије или активације. Стога, многи тестови генетске токсичности изведени у посудама или епруветама (ин витро) користе додавање сличних ензимских препарата. Једноставни препарати се називају С9 микс, а пречишћени микрозоми. Неке ћелије бактерија и сисара су сада генетски модификоване да садрже неке од гена глодара или људи који производе ове ензиме, смањујући потребу за додавањем С9 мешавине или микрозома.

Генетски токсиколошки тестови и технике

Примарни бактеријски системи који се користе за скрининг генетске токсичности су тест мутагености салмонеле (Амес) и, у много мањој мери, сој ВП2 од Есцхерицхиа цоли. Студије средином 1980-их су показале да је употреба само два соја Салмонелла система (ТА98 и ТА100) била довољна за откривање приближно 90% познатих мутагена салмонеле. Дакле, ова два соја се користе за већину скрининг сврха; међутим, разни други сојеви су доступни за опсежније тестирање.

Ови тестови се изводе на различите начине, али две опште процедуре су тестови уградње плоче и тестови суспензије течности. У тесту инкорпорације плоче, ћелије, испитивана хемикалија и (по жељи) С9 се додају заједно у течни агар и сипају на површину агар петријеве плоче. Горњи агар се стврдне у року од неколико минута, а плоче се инкубирају два до три дана, након чега су мутантне ћелије нарасле да формирају визуелно уочљиве групе ћелија које се називају колоније, које се затим броје. Агар медијум садржи селективне агенсе или је састављен од састојака тако да ће расти само новомутиране ћелије. Тест инкубације у течности је сличан, осим што се ћелије, тест агенс и С9 инкубирају заједно у течности која не садржи течни агар, а затим се ћелије исперу од тест агенса и С9 и засеју на агар.

Мутације у култивисаним ћелијама сисара се откривају првенствено у једном од два гена: хпрт tk. Слично као код бактеријских тестова, ћелијске линије сисара (развијене од ћелија глодара или људи) се излажу испитиваном агенсу у пластичним посудама за културу или епруветама, а затим се засеју у посуде за културу које садрже медијум са селективним агенсом који дозвољава само мутантним ћелијама да расту . Тестови који се користе у ову сврху укључују ЦХО/ХПРТ, ТК6 и мишји лимфом Л5178И/ТК^{+ / -} есеји. Користе се и друге ћелијске линије које садрже различите мутације за поправку ДНК, као и неке људске гене укључене у метаболизам. Ови системи дозвољавају опоравак мутација унутар гена (мутација гена), као и мутација које укључују регионе хромозома који прате ген (хромозомска мутација). Међутим, овај други тип мутације се обнавља у много већој мери tk генских система него по хпрт генских система због локације на tk ген.

Слично тесту инкубације у течности за бактеријску мутагеност, тестови мутагености ћелија сисара углавном укључују излагање ћелија у посудама за културу или епруветама у присуству тест агенса и С9 током неколико сати. Ћелије се затим исперу, култивишу још неколико дана да би се омогућило да се нормални (дивљи тип) генских производа разгради и да се нови мутантни генски производи експресују и акумулирају, а затим се засеју у медијум који садржи селективни агенс који дозвољава да расту само мутантне ћелије. Као и код бактеријских тестова, мутантне ћелије расту у визуелно уочљиве колоније које се затим броје.

Хромозомска мутација се идентификује првенствено цитогенетским тестовима, који укључују излагање глодара и/или ћелија глодара или људи у посудама за културу испитиваној хемикалији, омогућавајући једну или више деоба ћелија, бојење хромозома, а затим визуелно испитивање хромозома под микроскопом за откривање промена у структури или броју хромозома. Иако се могу испитати различите крајње тачке, две које регулаторне агенције тренутно прихватају као најзначајније су хромозомске аберације и поткатегорија која се зове микронуклеуси.

Потребна је значајна обука и стручност да би се ћелије процениле на присуство хромозомских аберација, што ову процедуру чини скупом у смислу времена и новца. Насупрот томе, микронуклеуси захтевају мало обуке, а њихово откривање може бити аутоматизовано. Микронуклеуси се појављују као мале тачке унутар ћелије које се разликују од језгра, које садржи хромозоме. Микронуклеуси су резултат или ломљења хромозома или анеуплоидије. Због лакоће оцењивања микронуклеуса у поређењу са хромозомским аберацијама и због тога што недавне студије показују да агенси који изазивају хромозомске аберације у коштаној сржи живих мишева генерално индукују микронуклеусе у овом ткиву, микронуклеуси се данас обично мере као показатељ способности агенс који изазива хромозомске мутације.

Иако се тестови заметних ћелија користе много ређе него други горе описани тестови, они су неопходни у одређивању да ли агенс представља ризик за заметне ћелије, мутације у којима могу довести до здравствених ефеката у наредним генерацијама. Најчешће коришћени тестови заметних ћелија су код мишева и укључују системе који откривају (1) наследне транслокације (размену) међу хромозомима (тест наследне транслокације), (2) генске или хромозомске мутације које укључују специфичне гене (видљиви или биохемијски специфични локус тестови) и (3) мутације које утичу на одрживост (доминантни тест смрти). Као и код тестова соматских ћелија, радна претпоставка код тестова заметних ћелија је да се претпоставља да су агенси позитивни у овим тестовима потенцијални мутагени људских заметних ћелија.

Тренутни статус и будући изгледи

Недавне студије су показале да су само три информације биле неопходне да би се открило приближно 90% скупа од 41 канцерогена за глодаре (тј. претпостављених карциногена за људе и мутагена соматских ћелија). Ово укључује (1) познавање хемијске структуре агенса, посебно ако садржи електрофилне делове (видети одељак о односима структуре и активности); (2) подаци о мутагености салмонеле; и (3) податке из 90-дневног теста хроничне токсичности код глодара (мишева и пацова). Заиста, сви хумани карциногени које је прогласио ИАРЦ могу се открити као мутагени користећи само тест салмонеле и микронуклеусни тест мишје коштане сржи. Употреба ових тестова мутагености за откривање потенцијалних канцерогена за људе је додатно подржана налазом да је већина канцерогена за људе канцерогена и код пацова и код мишева (канцерогени за транс-врсте) и да је већина канцерогена за транс-врсте мутагена у салмонели и/или индукују микронуклеусе. у коштаној сржи миша.

Са напретком у ДНК технологији, пројекту људског генома и побољшаним разумевањем улоге мутације у раку, развијају се нови тестови генотоксичности који ће вероватно бити укључени у стандардне процедуре скрининга. Међу њима је употреба трансгених ћелија и глодара. Трансгени системи су они у којима је ген друге врсте унет у ћелију или организам. На пример, трансгени мишеви су сада у експерименталној употреби која омогућава откривање мутације у било ком органу или ткиву животиње, на основу увођења бактеријског гена у миша. Сада су доступне бактеријске ћелије, као што је салмонела, и ћелије сисара (укључујући људске ћелијске линије) које садрже гене укључене у метаболизам канцерогених/мутагених агенаса, као што су гени П450. Молекуларна анализа стварних мутација индукованих у транс-гену код трансгених глодара, или унутар нативних гена као нпр. хпрт, или циљни гени унутар салмонеле сада се могу извести, тако да се може утврдити тачна природа мутација изазваних хемикалијама, пружајући увид у механизам деловања хемикалије и омогућавајући поређења са мутацијама код људи који су вероватно били изложени агенсу .

Молекуларни напредак у цитогенетици сада омогућава детаљнију процену хромозомских мутација. То укључује употребу сонди (малих делова ДНК) које се везују (хибридизују) за специфичне гене. Преуређивање гена на хромозому се тада може открити измењеном локацијом сонди, које су флуоресцентне и лако се визуализују као обојени сектори на хромозомима. Једноћелијски гел електрофорезни тест за ломљење ДНК (који се обично назива „кометски” тест) дозвољава откривање прекида ДНК унутар појединачних ћелија и може постати изузетно користан алат у комбинацији са цитогенетским техникама за откривање хромозомских оштећења.

После много година употребе и стварања велике и систематски развијене базе података, процена генетске токсичности сада се може урадити са само неколико тестова за релативно мале трошкове у кратком временском периоду (неколико недеља). Добијени подаци се могу користити за предвиђање способности неког агенса да буде глодар и, претпоставља се, хумани канцероген/мутаген соматских ћелија. Таква способност омогућава да се ограничи уношење мутагених и канцерогених агенаса у животну средину и да се развију алтернативни, немутагени агенси. Будуће студије би требало да доведу до још бољих метода са већом предиктивношћу од тренутних тестова.

Назад

Реч биомаркер је скраћеница за биолошки маркер, термин који се односи на мерљиви догађај који се дешава у биолошком систему, као што је људско тело. Овај догађај се онда тумачи као одраз, или маркер, општијег стања организма или очекиваног животног века. У здравству на раду, биомаркер се генерално користи као индикатор здравственог статуса или ризика од болести.

Биомаркери се користе за ин витро као и за ин виво студије које могу укључивати људе. Обично се идентификују три специфичне врсте биолошких маркера. Иако је неколико биомаркера тешко класификовати, они се обично деле на биомаркере изложености, биомаркере ефекта или биомаркере осетљивости (видети табелу 1).

Табела 1. Примери биомаркера изложености или биомаркера ефеката који се користе у токсиколошким студијама у здрављу на раду

Уз прихватљив степен ваљаности, биомаркери се могу користити у неколико намена. На индивидуалној основи, биомаркер се може користити да подржи или оповргне дијагнозу одређене врсте тровања или другог хемијски изазваног нежељеног ефекта. Код здравог субјекта, биомаркер такође може одражавати индивидуалну хиперсклоност специфичним хемикалијама и стога може послужити као основа за предвиђање ризика и саветовање. У групама изложених радника, неки биомаркери изложености могу се применити за процену степена усклађености са прописима о смањењу загађења или ефикасности превентивних напора уопште.

Биомаркери изложености

Биомаркер изложености може бити егзогено једињење (или метаболит) у телу, интерактивни производ између једињења (или метаболита) и ендогене компоненте, или други догађај повезан са изложеношћу. Најчешће, биомаркери изложености стабилним једињењима, као што су метали, обухватају мерења концентрација метала у одговарајућим узорцима, као што су крв, серум или урин. Код испарљивих хемикалија може се проценити њихова концентрација у издахнутом даху (након удисања ваздуха без контаминације). Ако се једињење метаболише у телу, један или више метаболита се може изабрати као биомаркер изложености; метаболити се често одређују у узорцима урина.

Савремене методе анализе могу омогућити раздвајање изомера или конгенера органских једињења, као и одређивање специјације металних једињења или изотопских односа појединих елемената. Софистициране анализе омогућавају одређивање промена у структури ДНК или других макромолекула изазваних везивањем са реактивним хемикалијама. Такве напредне технике ће без сумње значајно добити на значају за апликације у студијама биомаркера, а ниже границе детекције и боља аналитичка валидност ће вероватно учинити ове биомаркере још кориснијим.

Посебно обећавајући развој догодио се са биомаркерима изложености мутагеним хемикалијама. Ова једињења су реактивна и могу да формирају адукте са макромолекулима, као што су протеини или ДНК. Адукти ДНК могу се открити у белим крвним зрнцима или биопсијама ткива, а специфични фрагменти ДНК могу се излучити урином. На пример, излагање етилен оксиду доводи до реакција са ДНК базама, и, након ексцизије оштећене базе, Н-7-(2-хидроксиетил)гванин ће се елиминисати у урину. Неки адукти се можда не односе директно на одређену изложеност. На пример, 8-хидрокси-2´-деоксигуанозин одражава оксидативно оштећење ДНК, а ову реакцију може покренути неколико хемијских једињења, од којих већина такође индукује пероксидацију липида.

Други макромолекули се такође могу променити формирањем или оксидацијом адукта. Од посебног интереса, таква реактивна једињења могу да генеришу адукте хемоглобина који се могу одредити као биомаркери изложености једињењима. Предност је у томе што се из узорка крви могу добити велике количине хемоглобина, а с обзиром на четворомесечни животни век црвених крвних зрнаца, адукти формирани са амино киселинама протеина ће указивати на укупну изложеност током овог периода.

Адукти се могу одредити осетљивим техникама као што је липидна хроматографија високих перформанси, а доступне су и неке имунолошке методе. Генерално, аналитичке методе су нове, скупе и захтевају даљи развој и валидацију. Боља осетљивост се може постићи коришћењем ³²П тест обележавања након обележавања, што је неспецифична индикација да је дошло до оштећења ДНК. Све ове технике су потенцијално корисне за биолошки мониторинг и примењене су у све већем броју студија. Међутим, потребне су једноставније и осетљивије аналитичке методе. С обзиром на ограничену специфичност неких метода при ниском излагању, пушење дувана или други фактори могу значајно да утичу на резултате мерења, узрокујући потешкоће у интерпретацији.

Изложеност мутагеним једињењима, или једињењима која се метаболишу у мутагене, такође се може утврдити проценом мутагености урина изложене особе. Узорак урина се инкубира са сојем бактерија код којих је специфична тачкаста мутација изражена на начин који се лако може измерити. Ако су мутагене хемикалије присутне у узорку урина, онда ће се у бактеријама појавити повећана стопа мутација.

Биомаркери изложености се морају проценити с обзиром на временске варијације у изложености и однос према различитим одељцима. Дакле, временски оквир(и) представљени биомаркером, односно степен у коме мерење биомаркера одражава прошлу изложеност(е) и/или акумулирани терет тела, мора да се одреди из токсикокинетичких података да би се резултат интерпретирао. Посебно треба узети у обзир степен до којег биомаркер указује на задржавање у одређеним циљним органима. Иако се узорци крви често користе за студије биомаркера, периферна крв се генерално не сматра преградом као таквом, иако делује као транспортни медијум између одељења. Степен до којег концентрација у крви одражава нивое у различитим органима увелико варира између различитих хемикалија, а обично зависи и од дужине излагања, као и од времена од излагања.

Понекад се ова врста доказа користи за класификацију биомаркера као индикатора (укупне) апсорбоване дозе или индикатора ефективне дозе (тј. количине која је достигла циљно ткиво). На пример, излагање одређеном растварачу може се проценити на основу података о стварној концентрацији растварача у крви у одређено време након излагања. Ово мерење ће одражавати количину растварача који је апсорбован у тело. Део апсорбоване количине ће бити издахнут услед притиска паре растварача. Док циркулише у крви, растварач ће ступити у интеракцију са различитим компонентама тела и на крају ће постати подложан разградњи ензима. Исход метаболичких процеса може се проценити одређивањем специфичних меркаптурних киселина произведених коњугацијом са глутатионом. Кумулативно излучивање меркаптурних киселина може боље да одражава ефективну дозу него концентрација у крви.

Животни догађаји, као што су репродукција и старење, могу утицати на дистрибуцију хемикалије. Трудноћа значајно утиче на дистрибуцију хемикалија у телу, а многе хемикалије могу проћи плацентну баријеру, изазивајући излагање фетуса. Лактација може довести до излучивања хемикалија растворљивих у липидима, што доводи до смањеног задржавања код мајке заједно са повећаним уносом одојчета. Током губитка тежине или развоја остеопорозе, ускладиштене хемикалије се могу ослободити, што онда може довести до обновљеног и продуженог „ендогеног“ излагања циљних органа. Други фактори могу утицати на индивидуалну апсорпцију, метаболизам, задржавање и дистрибуцију хемијских једињења, а доступни су и неки биомаркери осетљивости (види доле).

Биомаркери ефекта

Маркер ефекта може бити ендогена компонента, или мера функционалног капацитета, или неки други индикатор стања или равнотеже тела или система органа, на који утиче изложеност. Такви маркери ефекта су генерално претклинички индикатори абнормалности.

Ови биомаркери могу бити специфични или неспецифични. Специфични биомаркери су корисни јер указују на биолошки ефекат одређене изложености, чиме се пружају докази који се потенцијално могу користити у превентивне сврхе. Неспецифични биомаркери не указују на појединачни узрок ефекта, али могу одражавати укупан, интегрисани ефекат због мешовите изложености. Обе врсте биомаркера стога могу бити од велике користи у здрављу на раду.

Не постоји јасна разлика између биомаркера изложености и биомаркера ефекта. На пример, могло би се рећи да формирање адукта одражава ефекат пре него излагање. Међутим, биомаркери ефекта обично указују на промене у функцијама ћелија, ткива или целог тела. Неки истраживачи укључују велике промене, као што је повећање тежине јетре изложених лабораторијских животиња или смањен раст код деце, као биомаркере ефекта. У сврху здравља на раду, биомаркери ефекта треба да буду ограничени на оне који указују на субклиничке или реверзибилне биохемијске промене, као што је инхибиција ензима. Најчешћи биомаркер ефекта је вероватно инхибиција холинестеразе коју изазивају одређени инсектициди, односно органофосфати и карбамати. У већини случајева, овај ефекат је потпуно реверзибилан, а инхибиција ензима одражава укупну изложеност овој одређеној групи инсектицида.

Нека излагања не доводе до инхибиције ензима, већ до повећане активности ензима. Ово је случај са неколико ензима који припадају породици П450 (погледајте „Генетске детерминанте токсичног одговора”). Они могу бити изазвани излагањем одређеним растварачима и полиароматичним угљоводоницима (ПАХ). Пошто се ови ензими углавном експримирају у ткивима из којих је тешко добити биопсију, активност ензима се одређује индиректно ин виво давањем једињења које се метаболише тим одређеним ензимом, а затим се производ разградње мери у урину или плазми.

Друге изложености могу изазвати синтезу заштитног протеина у телу. Најбољи пример је вероватно металотионеин, који везује кадмијум и подстиче излучивање овог метала; излагање кадмијуму је један од фактора који резултира повећаном експресијом гена за металотионеин. Слични заштитни протеини могу постојати, али још нису довољно истражени да би постали прихваћени као биомаркери. Међу кандидатима за могућу употребу као биомаркери су такозвани протеини стреса, првобитно названи протеини топлотног шока. Ове протеине генерише низ различитих организама као одговор на различита штетна излагања.

Оксидативно оштећење се може проценити одређивањем концентрације малондиалдехида у серуму или издисањем етана. Слично, излучивање протеина са малом молекулском тежином у урину, као што је албумин, може се користити као биомаркер раног оштећења бубрега. Неколико параметара који се рутински користе у клиничкој пракси (на пример, нивои серумских хормона или ензима) такође могу бити корисни као биомаркери. Међутим, многи од ових параметара можда нису довољно осетљиви да би се рано открило оштећење.

Друга група параметара ефеката односи се на генотоксичне ефекте (промене у структури хромозома). Такви ефекти се могу открити микроскопијом белих крвних зрнаца која пролазе кроз ћелијску деобу. Озбиљна оштећења хромозома — хромозомске аберације или формирање микронуклеуса — могу се видети под микроскопом. Оштећење се такође може открити додавањем боје ћелијама током ћелијске деобе. Излагање генотоксичном агенсу се тада може визуализовати као повећана размена боје између две хроматиде сваког хромозома (сестринска размена хроматида). Хромозомске аберације су повезане са повећаним ризиком од развоја канцера, али је значај повећане стопе размене сестринских хроматида мање јасан.

Софистициранија процена генотоксичности заснива се на одређеним тачкастим мутацијама у соматским ћелијама, односно белим крвним зрнцима или епителним ћелијама добијеним из оралне слузокоже. Мутација на одређеном локусу може учинити ћелије способним да расту у култури која садржи хемикалију која је иначе токсична (као што је 6-тиогуанин). Алтернативно, може се проценити специфични генски производ (нпр. концентрације онкопротеина у серуму или ткиву које кодирају одређени онкогени). Очигледно, ове мутације одражавају укупно настало генотоксично оштећење и не указују нужно на било шта о узрочној изложености. Ове методе још нису спремне за практичну употребу у здравству на раду, али брз напредак у овој линији истраживања би сугерисао да ће такве методе постати доступне у року од неколико година.

Биомаркери осетљивости

Маркер осетљивости, било наслеђен или индукован, је индикатор да је појединац посебно осетљив на дејство ксенобиотика или на ефекте групе таквих једињења. Највише пажње је усмерено на генетску подложност, иако други фактори могу бити барем једнако важни. Хиперсензибилност може бити последица наследне особине, конституције појединца или фактора околине.

Способност метаболизма одређених хемикалија је променљива и генетски је одређена (погледајте „Генетске детерминанте токсичног одговора”). Чини се да неколико релевантних ензима контролише један ген. На пример, оксидација страних хемикалија се углавном спроводи у породици ензима који припадају породици П450. Други ензими чине метаболите растворљивијим у води коњугацијом (нпр. Н-ацетилтрансфераза и μ-глутатион-S-трансфераза). Активност ових ензима је генетски контролисана и значајно варира. Као што је горе поменуто, активност се може одредити давањем мале дозе лека, а затим одређивањем количине метаболита у урину. Неки од гена су сада окарактерисани и доступне су технике за одређивање генотипа. Важне студије сугеришу да је ризик од развоја одређених облика рака повезан са способношћу метаболизма страних једињења. Многа питања и даље остају без одговора, чиме се у овом тренутку ограничава употреба ових потенцијалних биомаркера осетљивости у здрављу на раду.

Друге наследне особине, као што је алфа₁-недостатак антитрипсина или недостатак глукоза-6-фосфат дехидрогеназе, такође резултира недостатком одбрамбених механизама у телу, што узрокује преосјетљивост на одређене изложености.

Већина истраживања у вези са осетљивошћу бавила се генетском предиспозицијом. Други фактори такође играју улогу и делимично су занемарени. На пример, особе са хроничном болешћу могу бити осетљивије на професионалну изложеност. Такође, ако је процес болести или претходна изложеност токсичним хемикалијама изазвала нека субклиничка оштећења органа, онда ће капацитет да се издржи ново токсично излагање вероватно бити мањи. Биохемијски индикатори функције органа се у овом случају могу користити као биомаркери осетљивости. Можда најбољи пример у вези са хиперсензибилношћу односи се на алергијске реакције. Ако је појединац постао осетљив на одређену изложеност, тада се у серуму могу открити специфична антитела. Чак и ако појединац није постао сензибилизиран, друга тренутна или прошла изложеност може повећати ризик од развоја штетних ефеката повезаних са професионалном изложеношћу.

Велики проблем је утврдити заједнички ефекат мешовитих експозиција на раду. Поред тога, личне навике и употреба дрога могу довести до повећане осетљивости. На пример, дувански дим обично садржи значајну количину кадмијума. Дакле, уз професионалну изложеност кадмијуму, тешки пушач који је акумулирао значајне количине овог метала у телу биће изложен повећаном ризику од развоја болести бубрега повезаних са кадмијумом.

Примена у здравству на раду

Биомаркери су изузетно корисни у токсиколошким истраживањима, а многи могу бити применљиви у биолошком праћењу. Без обзира на то, ограничења се такође морају препознати. Многи биомаркери су до сада проучавани само на лабораторијским животињама. Токсикокинетички обрасци код других врста не морају нужно да одражавају ситуацију код људи, а екстраполација може захтевати потврдне студије на људским добровољцима. Такође, морају се узети у обзир индивидуалне варијације због генетских или уставних фактора.

У неким случајевима, биомаркери изложености можда уопште нису изводљиви (нпр. за хемикалије које су краткотрајне ин виво). Друге хемикалије се могу складиштити или могу утицати на органе којима се не може приступити рутинским процедурама, као што је нервни систем. Пут излагања такође може утицати на образац дистрибуције, а самим тим и на мерење биомаркера и његову интерпретацију. На пример, директно излагање мозга преко олфакторног нерва ће вероватно избећи детекцију мерењем биомаркера изложености. Што се тиче ефеката биомаркера, многи од њих нису уопште специфични, а промена може бити узрокована разним узроцима, укључујући факторе начина живота. Можда посебно у вези са биомаркерима осетљивости, тумачење у овом тренутку мора бити веома опрезно, пошто остаје много неизвесности у вези са укупним здравственим значајем појединачних генотипова.

У здравству на раду, идеални биомаркер треба да задовољи неколико захтева. Пре свега, прикупљање и анализа узорака морају бити једноставни и поуздани. За оптималан аналитички квалитет потребна је стандардизација, али специфични захтеви значајно варирају. Главне области које изазивају забринутост укључују: припрему појединца, поступак узорковања и руковање узорком и поступак мерења; ово последње обухвата техничке факторе, као што су процедуре калибрације и осигурања квалитета, и факторе везане за појединца, као што су образовање и обука оператера.

За документацију аналитичке валидности и следљивости, референтни материјали треба да се заснивају на релевантним матрицама и са одговарајућим концентрацијама токсичних супстанци или релевантних метаболита на одговарајућим нивоима. Да би се биомаркери користили за биолошки мониторинг или у дијагностичке сврхе, одговорне лабораторије морају имати добро документоване аналитичке процедуре са дефинисаним карактеристикама перформанси и доступне записе који омогућавају верификацију резултата. У исто време, без обзира на то, економичност карактеризације и коришћења референтних материјала као допуна процедура обезбеђења квалитета уопште мора бити узета у обзир. Стога, достижни квалитет резултата и употреба на коју се они користе, морају бити у равнотежи са додатним трошковима осигурања квалитета, укључујући референтне материјале, радну снагу и инструментацију.

Други захтев је да биомаркер треба да буде специфичан, барем под околностима студије, за одређену врсту изложености, са јасним односом према степену изложености. У супротном, резултат мерења биомаркера може бити превише тежак за тумачење. За правилно тумачење резултата мерења биомаркера изложености, мора бити позната дијагностичка валидност (тј. превод вредности биомаркера у величину могућих здравствених ризика). У овој области, метали служе као парадигма за истраживање биомаркера. Недавна истраживања су показала сложеност и суптилност односа доза-одговор, са значајним потешкоћама у идентификацији нивоа без ефекта, а самим тим и у дефинисању подношљивих излагања. Међутим, ова врста истраживања је такође илустровала врсте истраживања и префињености које су неопходне да би се откриле релевантне информације. За већину органских једињења, квантитативне везе између изложености и одговарајућих штетних ефеката на здравље још нису доступне; у многим случајевима чак ни примарни циљни органи нису поуздани. Поред тога, процена података о токсичности и концентрација биомаркера је често компликована излагањем смешама супстанци, пре него излагањем једном једињењу у то време.

Пре него што се биомаркер примени у сврхе здравља на раду, неопходна су нека додатна разматрања. Прво, биомаркер мора одражавати само субклиничку и реверзибилну промену. Друго, с обзиром на то да се резултати биомаркера могу тумачити у односу на ризике по здравље, онда превентивни напори треба да буду доступни и треба их сматрати реалистичним у случају да подаци о биомаркерима указују на потребу да се смањи изложеност. Треће, практична употреба биомаркера се генерално мора сматрати етички прихватљивом.

Мерења индустријске хигијене могу се упоредити са применљивим границама изложености. Слично томе, резултати о биомаркерима изложености или биомаркерима ефеката могу се упоредити са границама биолошког деловања, који се понекад називају индекси биолошке изложености. Таква ограничења би требало да буду заснована на најбољим саветима клиничара и научника из одговарајућих дисциплина, а одговорни администратори као „менаџери ризика“ треба да узму у обзир релевантне етичке, друштвене, културне и економске факторе. Научна основа би, ако је могуће, требало да укључи односе доза-одговор допуњене информацијама о варијацијама у осетљивости унутар ризичне популације. У неким земљама, радници и припадници опште јавности укључени су у процес постављања стандарда и дају важан допринос, посебно када је научна несигурност знатна. Једна од главних нејасноћа је како дефинисати нежељени ефекат на здравље који треба спречити—на пример, да ли формирање адукта као биомаркера изложености само по себи представља нежељени ефекат (тј. биомаркер ефекта) који треба спречити. Вероватно ће се појавити тешка питања када се одлучује да ли је етички одбрамбено да за исто једињење има различите границе за случајну изложеност, с једне стране, и професионалну изложеност, с друге.

Информације добијене употребом биомаркера генерално треба да се пренесу појединцима који се прегледају у оквиру односа лекар-пацијент. Етички проблеми се морају посебно размотрити у вези са високо експерименталним анализама биомаркера које се тренутно не могу детаљно тумачити у смислу стварних здравствених ризика. За општу популацију, на пример, тренутно постоје ограничене смернице у погледу тумачења биомаркера изложености осим концентрације олова у крви. Такође је важно поверење у добијене податке (тј. да ли је урађено одговарајуће узорковање и да ли су у укљученој лабораторији коришћене добре процедуре за обезбеђење квалитета). Додатна област посебне бриге односи се на индивидуалну преосјетљивост. Ова питања се морају узети у обзир приликом пружања повратних информација из студије.

Сви сектори друштва на које утиче студија о биомаркерима или се баве извођењем студије о биомаркерима морају бити укључени у процес доношења одлука о томе како поступати са информацијама добијеним од студије. Специфичне процедуре за спречавање или превазилажење неизбежних етичких сукоба треба да буду развијене у правним и друштвеним оквирима региона или земље. Међутим, свака ситуација представља другачији скуп питања и замки, и не може се развити јединствена процедура за укључивање јавности која би обухватила све примене биомаркера изложености.

Назад

Проучавање и карактеризација хемикалија и других агенаса за токсична својства често се предузима на основу специфичних органа и система органа. У овом поглављу, два циља су одабрана за детаљну дискусију: имуни систем и ген. Ови примери су одабрани да представљају сложен систем циљних органа и молекуларну мету унутар ћелија. За свеобухватнију дискусију о токсикологији циљних органа, читалац се упућује на стандардне токсиколошке текстове као што су Цасаретт анд Доулл, и Хаиес. Међународни програм за хемијску безбедност (ИПЦС) је такође објавио неколико критеријумских докумената о токсикологији циљних органа, по систему органа.

Токсиколошке студије циљних органа обично се спроводе на основу информација које указују на потенцијал за специфичне токсичне ефекте неке супстанце, било из епидемиолошких података или из студија опште акутне или хроничне токсичности, или на основу посебних забринутости за заштиту одређених функција органа, као што су као репродукција или развој фетуса. У неким случајевима, тестови токсичности специфичних циљних органа су изричито наложени од стране законских власти, као што је тестирање неуротоксичности у складу са америчким законом о пестицидима (погледајте „Приступ Сједињених Држава процјени ризика од репродуктивних токсиканата и неуротоксичних агенаса“ и тестирање мутагености према јапанском Цхемицал Закон о контроли супстанци (видети „Принципи идентификације опасности: јапански приступ“).

Као што је објашњено у одељку „Циљани орган и критични ефекти“, идентификација критичног органа заснива се на откривању органа или система органа који први реагују негативно или на најниже дозе или изложеност. Ове информације се затим користе за дизајнирање специфичних токсиколошких испитивања или више дефинисаних тестова токсичности који су дизајнирани да изазову осетљивије индикације интоксикације у циљном органу. Токсиколошке студије циљних органа такође се могу користити за одређивање механизама деловања, употребе у процени ризика (видети „Приступ Сједињених Држава процени ризика од репродуктивних токсиканата и неуротоксичних агенаса”).

Методе студија токсичности циљних органа

Циљни органи се могу проучавати излагањем интактних организама и детаљном анализом функције и хистопатологије у циљном органу, или ин витро излагањем ћелија, резова ткива или целих органа који се одржавају краткорочно или дуготрајно у култури (видети „Механизми токсикологија: Увод и појмови”). У неким случајевима, ткива људских субјеката могу такође бити доступна за студије токсичности за циљне органе, и то могу пружити могућности за валидацију претпоставки екстраполације међу врстама. Међутим, мора се имати на уму да такве студије не дају информације о релативној токсикокинетици.

Уопштено говорећи, студије токсичности циљног органа деле следеће заједничке карактеристике: детаљан хистопатолошки преглед циљног органа, укључујући пост мортем преглед, тежину ткива и преглед фиксираних ткива; биохемијске студије критичних путева у циљном органу, као што су важни ензимски системи; функционалне студије способности органа и ћелијских састојака да обављају очекиване метаболичке и друге функције; и анализа биомаркера изложености и раних ефеката у ћелијама циљних органа.

Детаљно познавање физиологије циљног органа, биохемије и молекуларне биологије може бити укључено у студије циљних органа. На пример, пошто је синтеза и секреција протеина мале молекуларне тежине важан аспект бубрежне функције, студије нефротоксичности често укључују посебну пажњу на ове параметре (ИПЦС 1991). Пошто је комуникација ћелија-ћелија основни процес функције нервног система, студије неуротоксичности циљних органа могу укључивати детаљна неурохемијска и биофизичка мерења синтезе неуротрансмитера, узимања, складиштења, ослобађања и везивања рецептора, као и електрофизиолошко мерење промена у мембрани. потенцијал повезан са овим догађајима.

Велики акценат се ставља на развој ин витро метода за токсичност циљних органа, како би се заменила или смањила употреба целих животиња. Значајан напредак у овим методама је постигнут за репродуктивне токсичне супстанце (Хеиндел и Цхапин 1993).

Укратко, студије токсичности циљних органа се генерално спроводе као тест вишег реда за одређивање токсичности. Избор специфичних циљних органа за даљу евалуацију зависи од резултата тестова на нивоу скрининга, као што су акутни или субхронични тестови које користе ОЕЦД и Европска унија; неки циљни органи и системи органа могу бити а приори кандидати за специјалну истрагу због забринутости за спречавање одређених врста штетних ефеката на здравље.

Назад

Функције имуног система су да заштити тело од инвазије инфективних агенаса и да обезбеди имунолошки надзор против туморских ћелија које настају. Има прву линију одбране која је неспецифична и која сама може да покрене ефекторске реакције и стечену специфичну грану, у којој лимфоцити и антитела носе специфичност препознавања и накнадне реактивности према антигену.

Имунотоксикологија је дефинисана као „дисциплина која се бави проучавањем догађаја који могу довести до нежељених ефеката као резултат интеракције ксенобиотика са имунолошким системом. Ови нежељени догађаји могу резултирати као последица (1) директног и/или индиректног ефекта ксенобиотика (и/или његовог производа биотрансформације) на имуни систем, или (2) имунолошки заснованог одговора домаћина на једињење и/или његов метаболит(и), или антигени домаћина модификовани једињењем или његовим метаболитима” (Берлин ет ал. 1987).

Када имуни систем делује као пасивна мета хемијских увреда, резултат може бити смањена отпорност на инфекцију и одређене облике неоплазије, или имунолошка дисрегулација/стимулација која може погоршати алергију или ауто-имунитет. У случају да имуни систем реагује на антигенску специфичност ксенобиотика или антигена домаћина модификованог једињењем, токсичност се може манифестовати као алергије или аутоимуне болести.

Развијени су животињски модели за испитивање супресије имунитета изазване хемикалијама, а један број ових метода је потврђен (Бурлесон, Мунсон и Деан 1995; ИПЦС 1996). За потребе тестирања, следи вишестепени приступ како би се направио адекватан избор од огромног броја доступних тестова. Генерално, циљ првог нивоа је да идентификује потенцијалне имунотоксичне супстанце. Ако се идентификује потенцијална имунотоксичност, врши се други ниво тестирања да би се потврдиле и даље карактерисале уочене промене. Истраживања трећег нивоа укључују посебне студије о механизму деловања једињења. Неколико ксенобиотика је идентификовано као имунотоксиканти који изазивају имуносупресију у таквим студијама на лабораторијским животињама.

База података о поремећајима имунолошке функције код људи услед хемикалија из животне средине је ограничена (Десцотес 1986; НРЦ Подкомитет за имунотоксикологију 1992). Употреба маркера имунотоксичности је добила мало пажње у клиничким и епидемиолошким студијама да би се истражио ефекат ових хемикалија на здравље људи. Такве студије нису рађене често, а њихово тумачење често не дозвољава да се донесу недвосмислени закључци, на пример због неконтролисане природе излагања. Стога, тренутно процена имунотоксичности код глодара, са накнадном екстраполацијом на човека, чини основу за доношење одлука о опасности и ризику.

Реакције преосетљивости, посебно алергијска астма и контактни дерматитис, су важни здравствени проблеми у индустријализованим земљама (Вос, Иоунес и Смитх 1995). Феномен контактне сензибилизације је прво истражен код заморца (Андерсен и Маибацх 1985). До недавно је ово била врста избора за предиктивно тестирање. Доступне су многе методе тестирања заморчића, а најчешће коришћени су тест максимизације заморчића и Буехлеров тест оклудираних закрпа. Тестови на заморцима и новији приступи развијени на мишевима, као што су тестови отицања уха и тест локалних лимфних чворова, пружају токсикологу алате за процену опасности од сензибилизације коже. Ситуација у погледу сензибилизације респираторног тракта је веома различита. Још увек не постоје добро потврђене или широко прихваћене методе за идентификацију хемијских респираторних алергена, иако је напредак у развоју животињских модела за испитивање хемијских респираторних алергија постигнут код заморца и миша.

Подаци о људима показују да хемијски агенси, посебно лекови, могу изазвати аутоимуне болести (Каммуллер, Блоксма и Сеинен 1989). Постоји велики број експерименталних животињских модела људских аутоимуних болести. Оне обухватају и спонтану патологију (на пример системски еритематозни лупус код новозеландских црних мишева) и аутоимуне феномене изазване експерименталном имунизацијом унакрсним реактивним аутоантигеном (на пример, артритис изазван Х37Ра адјувансом код пацова соја Левис). Ови модели се примењују у претклиничкој евалуацији имуносупресивних лекова. Врло мало студија бавило се потенцијалом ових модела за процену да ли ксенобиотик погоршава индуковану или урођену аутоимуност. Животињски модели који су погодни за истраживање способности хемикалија да изазову аутоимуне болести практично недостају. Један модел који се користи у ограниченој мери је тест поплитеалних лимфних чворова код мишева. Као и ситуација код људи, генетски фактори играју кључну улогу у развоју аутоимуне болести (АД) код лабораторијских животиња, што ће ограничити предиктивну вредност таквих тестова.

Имунски систем

Главна функција имуног система је одбрана од бактерија, вируса, паразита, гљивица и неопластичних ћелија. Ово се постиже деловањем различитих типова ћелија и њихових растворљивих медијатора у фино подешеном концерту. Одбрана домаћина може се грубо поделити на неспецифичну или урођену резистенцију и специфичан или стечени имунитет посредован лимфоцитима (Роитт, Бростофф и Мале 1989).

Компоненте имуног система присутне су у целом телу (Јонес ет ал. 1990). Компартмент за лимфоците се налази у лимфоидним органима (слика 1). Коштана срж и тимус су класификовани као примарни или централни лимфоидни органи; секундарни или периферни лимфоидни органи обухватају лимфне чворове, слезину и лимфоидно ткиво дуж секреторних површина као што су гастроинтестинални и респираторни тракт, такозвано лимфоидно ткиво повезано са слузницом (МАЛТ). Отприлике половина телесних лимфоцита налази се у било ком тренутку у МАЛТ-у. Поред тога, кожа је важан орган за индукцију имунолошких одговора на антигене присутне на кожи. Важне у овом процесу су епидермалне Лангерхансове ћелије које имају функцију презентовања антигена.

Слика 1. Примарни и секундарни лимфоидни органи и ткива

Фагоцитне ћелије лозе моноцита/макрофага, назване мононуклеарни фагоцитни систем (МПС), јављају се у лимфоидним органима и такође на екстранодалним местима; екстранодални фагоцити укључују Купферове ћелије у јетри, алвеоларне макрофаге у плућима, мезангијалне макрофаге у бубрезима и глијалне ћелије у мозгу. Полиморфонуклеарни леукоцити (ПМН) су углавном присутни у крви и коштаној сржи, али се акумулирају на местима упале.

Неспецифична одбрана

Прву линију одбране од микроорганизама врши физичка и хемијска баријера, као што су кожа, респираторни и пробавни тракт. Ова баријера је потпомогнута неспецифичним заштитним механизмима укључујући фагоцитне ћелије, као што су макрофаги и полиморфонуклеарни леукоцити, који су у стању да убијају патогене, и природне ћелије убице, које могу да лизирају ћелије тумора и ћелије инфициране вирусом. Систем комплемента и одређени микробни инхибитори (нпр. лизозим) такође учествују у неспецифичном одговору.

Специфични имунитет

Након почетног контакта домаћина са патогеном, индукују се специфични имуни одговори. Обележје ове друге линије одбране је специфично препознавање детерминанти, такозваних антигена или епитопа, патогена помоћу рецептора на површини ћелије Б- и Т-лимфоцита. Након интеракције са специфичним антигеном, ћелија која носи рецептор се стимулише да се подвргне пролиферацији и диференцијацији, производећи клон ћелија потомака који су специфични за изазивајући антиген. Специфични имуни одговори помажу неспецифичној одбрани представљеној патогенима стимулишући ефикасност неспецифичних одговора. Основна карактеристика специфичног имунитета је да се памћење развија. Секундарни контакт са истим антигеном изазива бржи и снажнији, али добро регулисан одговор.

Геном нема капацитет да носи кодове низа антигенских рецептора који су довољни да препознају број антигена који се могу срести. Репертоар специфичности се развија процесом преуређивања гена. Ово је случајан процес, током којег се јављају различите специфичности. Ово укључује специфичности сопствених компоненти, које су непожељне. Процес селекције који се одвија у тимусу (Т ћелије) или коштаној сржи (Б ћелије) ради на брисању ових непожељних специфичности.

Нормална имунолошка ефекторска функција и хомеостатска регулација имуног одговора зависе од низа растворљивих производа, познатих као цитокини, које синтетишу и луче лимфоцити и други типови ћелија. Цитокини имају плеиотропне ефекте на имуне и инфламаторне одговоре. Сарадња између различитих ћелијских популација је неопходна за имуни одговор — регулацију одговора антитела, акумулацију имуних ћелија и молекула на местима упале, иницирање одговора акутне фазе, контролу цитотоксичне функције макрофага и многе друге процесе који су централни за отпорност домаћина. . На њих утичу и у многим случајевима зависе од цитокина који делују појединачно или заједно.

Препознају се два крака специфичног имунитета—хуморални имунитет и ћелијски посредован или ћелијски имунитет:

Хуморални имунитет. У хуморалном краку Б-лимфоцити се стимулишу након што рецептори на ћелијској површини препознају антиген. Антигенски рецептори на Б-лимфоцитима су имуноглобулини (Иг). Зреле Б ћелије (плазма ћелије) започињу производњу антиген-специфичних имуноглобулина који делују као антитела у серуму или дуж мукозних површина. Постоји пет главних класа имуноглобулина: (1) ИгМ, пентамерни Иг са оптималним капацитетом аглутинације, који се прво производи након антигенске стимулације; (2) ИгГ, главни Иг у циркулацији, који може да прође кроз плаценту; (3) ИгА, секреторни Иг за заштиту мукозних површина; (4) ИгЕ, Иг фиксирање за мастоците или базофилне гранулоците укључене у непосредне реакције преосетљивости и (5) ИгД, чија је главна функција рецептор на Б-лимфоцитима.

Ћелијски посредован имунитет. Ћелијски крак специфичног имуног система је посредован Т-лимфоцитима. Ове ћелије такође имају рецепторе за антиген на својим мембранама. Они препознају антиген ако су представљени ћелијама које представљају антиген у контексту антигена хистокомпатибилности. Дакле, ове ћелије имају ограничење поред специфичности антигена. Т ћелије функционишу као помоћне ћелије за различите (укључујући хуморалне) имуне одговоре, посредују у регрутовању инфламаторних ћелија и могу, као цитотоксичне Т ћелије, да убијају циљне ћелије након антиген-специфичног препознавања.

Механизми имунотоксичности

Имуносупресија

Ефективна резистенција домаћина зависи од функционалног интегритета имуног система, што заузврат захтева да компоненте ћелија и молекула који оркестрирају имуни одговор буду доступни у довољном броју иу оперативном облику. Урођене имунодефицијенције код људи често се карактеришу дефектима одређених линија матичних ћелија, што доводи до поремећене или одсутне производње имуних ћелија. По аналогији са урођеним и стеченим болестима хумане имунодефицијенције, хемијски изазвана имуносупресија може бити резултат једноставног смањења броја функционалних ћелија (ИПЦС 1996). Одсуство или смањен број лимфоцита може имати више или мање дубоке ефекте на имунолошки статус. Нека стања имунодефицијенције и тешка имуносупресија, који се могу јавити у трансплантацији или цитостатичкој терапији, повезани су посебно са повећаном инциденцом опортунистичких инфекција и одређених неопластичних болести. Инфекције могу бити бактеријске, вирусне, гљивичне или протозојске, а преовлађујући тип инфекције зависи од придружене имунодефицијенције. Може се очекивати да ће излагање имуносупресивним хемикалијама из животне средине довести до суптилнијих облика имуносупресије, што може бити тешко открити. Ово може довести, на пример, до повећане инциденције инфекција као што су грип или обична прехлада.

С обзиром на сложеност имуног система, са широким спектром ћелија, медијатора и функција које чине компликовану и интерактивну мрежу, имунотоксична једињења имају бројне могућности да испоље дејство. Иако природа почетних лезија изазваних многим имунотоксичним хемикалијама још увек није разјашњена, све је више доступних информација, углавном изведених из студија на лабораторијским животињама, у вези са имунобиолошким променама које доводе до депресије имунолошке функције (Деан ет ал. 1994.) . Токсични ефекти могу се јавити на следећим критичним функцијама (и дати су неки примери имунотоксичних једињења која утичу на ове функције):

•  развој и ширење различитих популација матичних ћелија (бензен испољава имунотоксичне ефекте на нивоу матичних ћелија, изазивајући лимфоцитопенију)
•  пролиферација различитих лимфоидних и мијелоидних ћелија, као и потпорних ткива у којима ове ћелије сазревају и функционишу (имунотоксична органокалајна једињења сузбијају пролиферативну активност лимфоцита у тимусној кортексу путем директне цитотоксичности; тимотоксично дејство 2,3,7,8-тетрахлоро -дибензо-п-диоксин (ТЦДД) и сродна једињења су вероватно због поремећене функције епителних ћелија тимуса, а не због директне токсичности за тимоците)
•  преузимање, процесирање и презентација антигена од стране макрофага и других ћелија које представљају антиген (једна од мета 7,12-диметилбенз(а)антрацена (ДМБА) и олова је презентација антигена од стране макрофага; мета ултраљубичастог зрачења је антиген- представљање Лангерхансове ћелије)
•  регулаторна функција Т-помоћних и Т-супресорских ћелија (функција Т-помоћних ћелија је оштећена органотинима, алдикарбом, полихлорисаним бифенилима (ПЦБ), ТЦДД и ДМБА; функција Т-супресорских ћелија је смањена третманом ниским дозама циклофосфамида)
•  производња различитих цитокина или интерлеукина (бензо(а)пирен (БП) потискује производњу интерлеукина-1; ултраљубичасто зрачење мења производњу цитокина од стране кератиноцита)
•  синтеза различитих класа имуноглобулина ИгМ и ИгГ је потиснута након третмана ПЦБ и трибутилкалај оксидом (ТБТ), и повећана након излагања хексахлоробензену (ХЦБ).
•  регулација и активација комплемента (под утицајем ТЦДД)
•  цитотоксична функција Т ћелија (3-метилхолантрен (3-МЦ), ДМБА и ТЦДД потискују цитотоксичну активност Т ћелија)
•  функција природних ћелија убица (НК) (плућна НК активност је потиснута озоном; НК активност слезине је оштећена никлом)
•  хемотаксија макрофага и полиморфонуклеарних леукоцита и цитотоксичне функције (озон и азот-диоксид нарушавају фагоцитну активност алвеоларних макрофага).

Алергија

Алергија могу се дефинисати као штетни здравствени ефекти који су резултат индукције и изазивања специфичних имуних одговора. Када се реакције преосетљивости јављају без укључивања имуног система термин псеудо-алергија се користи. У контексту имунотоксикологије, алергија је резултат специфичног имунолошког одговора на хемикалије и лекове који су од интереса. Способност хемикалије да сензибилизира појединце је генерално повезана са њеном способношћу да се ковалентно везује за телесне протеине. Алергијске реакције могу имати различите облике и оне се разликују у односу на основне имунолошке механизме и брзину реакције. Препознате су четири главне врсте алергијских реакција: Реакције преосетљивости типа И, које изазивају ИгЕ антитело и код којих се симптоми манифестују у року од неколико минута након излагања сензибилизоване особе. Реакције преосетљивости типа ИИ су резултат оштећења или уништења ћелија домаћина антителом. У овом случају симптоми постају очигледни у року од неколико сати. Реакције преосетљивости типа ИИИ или Артусове реакције су такође посредоване антителима, али против растворљивог антигена, и резултат су локалног или системског деловања имуних комплекса. На реакције типа ИВ, или преосетљивост одложеног типа, утичу Т-лимфоцити и обично се симптоми развијају 24 до 48 сати након излагања сензибилизоване особе.

Две врсте хемијских алергија од највећег значаја за здравље на раду су осетљивост на контакт или алергија коже и алергија респираторног тракта.

Контактна преосетљивост. Велики број хемикалија може изазвати сензибилизацију коже. Након локалног излагања осетљиве особе хемијском алергену, одговор Т-лимфоцита се индукује у дренирајућим лимфним чворовима. У кожи алерген директно или индиректно ступа у интеракцију са епидермалним Лангерхансовим ћелијама, које транспортују хемикалију до лимфних чворова и представљају је у имуногеном облику Т-лимфоцитима који реагују. Т-лимфоцити активирани алергеном пролиферирају, што доводи до клоналне експанзије. Појединац је сада сензибилизиран и реаговаће на друго дермално излагање истој хемикалији агресивнијим имунолошким одговором, што резултира алергијским контактним дерматитисом. Кожна инфламаторна реакција која карактерише алергијски контактни дерматитис је секундарна у односу на препознавање алергена у кожи од стране специфичних Т-лимфоцита. Ови лимфоцити се активирају, ослобађају цитокине и изазивају локалну акумулацију других мононуклеарних леукоцита. Симптоми се развијају око 24 до 48 сати након излагања сензибилизоване особе, па стога алергијски контактни дерматитис представља облик преосетљивости одложеног типа. Уобичајени узроци алергијског контактног дерматитиса укључују органске хемикалије (као што је 2,4-динитрохлоробензен), метале (као што су никл и хром) и биљне производе (као што је урушиол из отровног бршљана).

Респираторна преосетљивост. Респираторна преосетљивост се обично сматра реакцијом преосетљивости типа И. Међутим, реакције у касној фази и хроничнији симптоми повезани са астмом могу укључити ћелијски посредоване (тип ИВ) имуне процесе. На акутне симптоме повезане са респираторном алергијом утиче ИгЕ антитело, чија производња се провоцира након излагања осетљиве особе индукујућем хемијском алергену. ИгЕ антитело се дистрибуира системски и везује се, преко мембранских рецептора, за мастоците које се налазе у васкуларизованим ткивима, укључујући респираторни тракт. Након удисања исте хемикалије долази до реакције респираторне преосетљивости. Алерген се повезује са протеином и везује се за ИгЕ антитела везана за мастоците и унакрсно повезује. Ово заузврат изазива дегранулацију мастоцита и ослобађање инфламаторних медијатора као што су хистамин и леукотриени. Такви медијатори изазивају бронхоконстрикцију и вазодилатацију, што резултира симптомима респираторне алергије; астма и/или ринитис. Хемикалије за које се зна да изазивају респираторну преосетљивост код људи укључују анхидриде киселине (као што је тримелитни анхидрид), неке диизоцијанате (као што је толуен диизоцијанат), соли платине и неке реактивне боје. Такође, познато је да хронична изложеност берилијуму изазива преосетљивост плућа.

Аутоимунитет

Аутоимунитет може се дефинисати као стимулација специфичних имуних одговора усмерених против ендогених „самосталних” антигена. Индукована аутоимуност може бити резултат или промена у равнотежи регулаторних Т-лимфоцита или због повезаности ксенобиотика са компонентама нормалног ткива тако да их чини имуногеним („измењено ја“). Лекови и хемикалије за које се зна да случајно изазивају или погоршавају ефекте попут оних код аутоимуне болести (АД) код осетљивих појединаца су једињења мале молекулске тежине (молекулске тежине 100 до 500) за која се генерално сматра да сама по себи нису имуногена. Механизам АД услед излагања хемикалијама углавном је непознат. Болест се може произвести директно помоћу циркулишућих антитела, индиректно кроз формирање имунских комплекса, или као последица ћелијски посредованог имунитета, али се вероватно јавља комбинацијом механизама. Патогенеза је најпознатија код имунолошких хемолитичких поремећаја изазваних лековима:

•  Лек се може везати за мембрану црвених ћелија и ступити у интеракцију са антителом специфичним за лек.
•  Лек може да промени мембрану црвених ћелија тако да имуни систем сматра ћелију страном.
•  Лек и његово специфично антитело формирају имуне комплексе који се везују за мембрану црвених ћелија и изазивају повреде.
•  Сензибилизација црвених ћелија настаје услед производње аутоантитела црвених ћелија.

Утврђено је да разне хемикалије и лекови, посебно ове последње, изазивају аутоимуне реакције (Камуллер, Блоксма и Сеинен 1989). Професионална изложеност хемикалијама може случајно довести до синдрома сличних АД. Излагање мономерном винил хлориду, трихлоретилену, перхлоретилену, епоксидним смолама и силицијум прашини може изазвати синдроме сличне склеродерми. Синдром сличан системском еритематозусу (СЛЕ) описан је након излагања хидразину. Излагање толуен диизоцијанату је повезано са индукцијом тромбоцитопеничне пурпуре. Тешки метали као што је жива су укључени у неке случајеве имунокомплексног гломерулонефритиса.

Процена људског ризика

Процена имуног статуса човека се врши углавном коришћењем периферне крви за анализу хуморалних супстанци као што су имуноглобулини и комплемент, и леукоцита крви за састав подскупа и функционалност субпопулација. Ове методе су обично исте као оне које се користе за испитивање хуморалног и ћелијски посредованог имунитета, као и неспецифичне резистенције пацијената са сумњом на болест урођене имунодефицијенције. За епидемиолошке студије (нпр. професионално изложене популације) параметре треба изабрати на основу њихове предиктивне вредности у људским популацијама, валидираних животињских модела и основне биологије маркера (видети табелу 1). Стратегија скрининга на имунотоксичне ефекте након (случајног) излагања загађивачима животне средине или другим токсичним супстанцама у великој мери зависи од околности, као што су тип имунодефицијенције који се очекује, време између излагања и процене имунолошког статуса, степен изложености и број изложених особа. Процес процене имунотоксичног ризика од одређеног ксенобиотика код људи је изузетно тежак и често немогућ, углавном због присуства различитих збуњујућих фактора ендогеног или егзогеног порекла који утичу на одговор појединаца на токсично оштећење. Ово посебно важи за студије које истражују улогу излагања хемикалијама у аутоимуним болестима, где генетски фактори играју кључну улогу.

Табела 1. Класификација тестова за имунолошке маркере

Пошто су адекватни подаци о људима ретко доступни, процена ризика за имуносупресију изазвану хемикалијама код људи се у већини случајева заснива на студијама на животињама. Идентификација потенцијалних имунотоксичних ксенобиотика се спроводи првенствено у контролисаним студијама на глодарима. Студије изложености ин виво представљају, у том погледу, оптималан приступ за процену имунотоксичног потенцијала једињења. Ово је због мултифакторске и сложене природе имуног система и имунолошких одговора. Ин витро студије су све веће вредности у разјашњавању механизама имунотоксичности. Поред тога, истраживањем ефеката једињења коришћењем ћелија животињског и људског порекла, могу се добити подаци за поређење врста, који се могу користити у „паралелограмском“ приступу за побољшање процеса процене ризика. Ако су доступни подаци за три камена темељца паралелограма (ин виво животиње, ин витро животиње и људи), можда ће бити лакше предвидети исход на преосталом камену темељцу, односно ризик код људи.

Када се процена ризика за имуносупресију изазвану хемикалијама мора ослањати искључиво на податке из студија на животињама, може се следити приступ у екстраполацији на човека применом фактора несигурности на ниво без уочених штетних ефеката (НОАЕЛ). Овај ниво се може заснивати на параметрима одређеним у релевантним моделима, као што су тестови резистенције домаћина и ин виво процена реакција преосетљивости и производње антитела. У идеалном случају, релевантност овог приступа у процени ризика захтева потврду студија на људима. Такве студије треба да комбинују идентификацију и мерење токсичности, епидемиолошке податке и процену имунолошког статуса.

Да би се предвидела контактна преосетљивост, доступни су модели заморчића који се користе у процени ризика од 1970-их. Иако су осетљиви и поновљиви, ови тестови имају ограничења јер зависе од субјективне процене; ово се може превазићи новијим и квантитативнијим методама развијеним у мишу. Што се тиче хемијске индуковане преосетљивости изазване удисањем или гутањем алергена, тестове треба развити и проценити у смислу њихове предиктивне вредности код човека. Када је у питању постављање безбедних нивоа изложености потенцијалним алергенима на радном месту, мора се узети у обзир двофазна природа алергије: фаза сензибилизације и фаза изазивања. Концентрација потребна за изазивање алергијске реакције код претходно сензибилизоване особе је знатно нижа од концентрације неопходне да се изазове сензибилизација код имунолошки наивне, али осетљиве особе.

Како животињски модели за предвиђање аутоимуности изазване хемикалијама практично недостају, нагласак треба дати развоју таквих модела. За развој таквих модела, наше знање о хемијском индукованој аутоимуности код људи требало би да се унапреди, укључујући проучавање генетских маркера и маркера имуног система за идентификацију осетљивих појединаца. Људи који су изложени лековима који изазивају аутоимуност нуде такву прилику.

Назад

Генетска токсикологија, по дефиницији, је студија о томе како хемијски или физички агенси утичу на замршени процес наслеђа. Генотоксичне хемикалије се дефинишу као једињења која су способна да модификују наследни материјал живих ћелија. Вероватноћа да ће одређена хемикалија изазвати генетско оштећење неизбежно зависи од неколико варијабли, укључујући ниво изложености организма хемикалији, дистрибуцију и задржавање хемикалије када уђе у тело, ефикасност метаболичке активације и/или система детоксикације у циљна ткива, и реактивност хемикалије или њених метаболита са критичним макромолекулима унутар ћелија. Вероватноћа да ће генетско оштећење изазвати болест на крају зависи од природе оштећења, способности ћелије да поправи или појача генетско оштећење, могућности да изрази било коју промену која је изазвана, и способности тела да препозна и потисне умножавање аберантне ћелије.

У вишим организмима, наследне информације су организоване у хромозомима. Хромозоми се састоје од чврсто кондензованих ланаца ДНК повезане са протеинима. У оквиру једног хромозома, сваки молекул ДНК постоји као пар дугих, неразгранатих ланаца нуклеотидних подјединица повезаних фосфодиестарским везама које спајају 5 угљеника једног дела дезоксирибозе са 3 угљеника следећег (слика 1). Поред тога, једна од четири различите нуклеотидне базе (аденин, цитозин, гванин или тимин) је везана за сваку подјединицу дезоксирибозе као перле на нити. Тродимензионално, сваки пар ланаца ДНК формира двоструку спиралу са свим базама оријентисаним ка унутрашњости спирале. Унутар хеликса, свака база је повезана са својом комплементарном базом на супротном ДНК ланцу; водонична веза диктира снажно, нековалентно упаривање аденина са тимином и гванина са цитозином (слика 1). Пошто је секвенца нуклеотидних база комплементарна целом дужином молекула дуплекс ДНК, оба ланца носе у суштини исте генетске информације. У ствари, током репликације ДНК сваки ланац служи као шаблон за производњу новог партнерског ланца.

Слика 1. (а) примарна, (б) секундарна и (ц) терцијарна организација људских наследних информација

Користећи РНК и низ различитих протеина, ћелија на крају дешифрује информације кодиране линеарном секвенцом база унутар специфичних региона ДНК (гена) и производи протеине који су неопходни за опстанак основних ћелија, као и за нормалан раст и диференцијацију. У суштини, нуклеотиди функционишу као биолошка абецеда која се користи за кодирање аминокиселина, градивних блокова протеина.

Када се уметну нетачни нуклеотиди или се нуклеотиди изгубе, или када се додају непотребни нуклеотиди током синтезе ДНК, грешка се назива мутација. Процењено је да се на сваких 10 јавља мање од једне мутације⁹ нуклеотиди уграђени током нормалне репликације ћелија. Иако мутације нису нужно штетне, промене које изазивају инактивацију или прекомерну експресију важних гена могу довести до разних поремећаја, укључујући рак, наследне болести, развојне абнормалности, неплодност и ембрионалну или перинаталну смрт. Веома ретко, мутација може довести до побољшаног преживљавања; такве појаве су основа природне селекције.

Иако неке хемикалије реагују директно са ДНК, већина захтева метаболичку активацију. У последњем случају, електрофилни интермедијери као што су епоксиди или јони угљеника су на крају одговорни за изазивање лезија на различитим нуклеофилним местима унутар генетског материјала (слика 2). У другим случајевима, генотоксичност је посредована нуспроизводима интеракције једињења са интрацелуларним липидима, протеинима или кисеоником.

Слика 2. Биоактивација: а) бензо(а)пирена; и б) Н-нитрозодиметиламин

Због њиховог релативног обиља у ћелијама, протеини су најчешћа мета интеракције токсичних супстанци. Међутим, модификација ДНК изазива већу забринутост због централне улоге овог молекула у регулисању раста и диференцијације кроз више генерација ћелија.

На молекуларном нивоу, електрофилна једињења имају тенденцију да нападају кисеоник и азот у ДНК. Локације које су најсклоне модификацијама илустроване су на слици 3. Иако су кисеоник унутар фосфатних група у ДНК кичми такође мета за хемијску модификацију, сматра се да је оштећење база биолошки релевантније јер се ове групе сматрају примарним информативним елемената у молекулу ДНК.

Слика 3. Примарна места хемијски изазваних оштећења ДНК

Једињења која садрже један електрофилни део обично испољавају генотоксичност тако што производе моно-адукте у ДНК. Слично томе, једињења која садрже два или више реактивних делова могу да реагују са два различита нуклеофилна центра и на тај начин произведу интра- или интер-молекуларне попречне везе у генетском материјалу (слика 4). Унакрсне везе између ДНК-ДНК и ДНК-протеина могу бити посебно цитотоксичне јер могу формирати потпуне блокове за репликацију ДНК. Из очигледних разлога, смрт ћелије елиминише могућност да ће бити мутирана или неопластично трансформисана. Генотоксични агенси такође могу деловати тако што изазивају прекиде у фосфодиестарској кичми, или између база и шећера (производећи абазична места) у ДНК. Такви прекиди могу бити директан резултат хемијске реактивности на месту оштећења или се могу јавити током поправке једног од горе наведених типова лезија ДНК.

Слика 4. Разне врсте оштећења комплекса протеин-ДНК

Током протеклих тридесет до четрдесет година развијене су различите технике за праћење врсте генетских оштећења изазваних разним хемикалијама. Такви тестови су детаљно описани на другом месту у овом поглављу и Енциклопедија.

Погрешна репликација „микролезија“ као што су моно-адукти, абазична места или прекиди једног ланца може на крају довести до супституција нуклеотидних базних парова, или уметања или брисања кратких полинуклеотидних фрагмената у хромозомској ДНК. Насупрот томе, „макролезије“, као што су гломазни адукти, унакрсне везе или прекиди двоструког ланца, могу изазвати добијање, губитак или преуређење релативно великих делова хромозома. У сваком случају, последице могу бити погубне по организам јер било који од ових догађаја може довести до смрти ћелије, губитка функције или малигне трансформације ћелија. Како тачно оштећење ДНК узрокује рак је углавном непознато. Тренутно се верује да процес може укључивати неодговарајућу активацију прото-онкогена као што је нпр миц Рас, и/или инактивација недавно идентификованих гена супресора тумора као што је п53. Абнормална експресија било ког типа гена укида нормалне ћелијске механизме за контролу пролиферације и/или диференцијације ћелија.

Превласт експерименталних доказа указује да је развој канцера након излагања електрофилним једињењима релативно редак догађај. Ово се делимично може објаснити интринзичном способношћу ћелије да препозна и поправи оштећену ДНК или неуспехом ћелија са оштећеном ДНК да преживе. Током поправке, оштећена база, нуклеотид или кратак део нуклеотида који окружује место оштећења се уклања и (користећи супротни ланац као шаблон) нови део ДНК се синтетише и спаја на место. Да би била ефикасна, поправка ДНК мора да се деси са великом тачношћу пре деобе ћелије, пре него што дође до могућности за ширење мутације.

Клиничке студије су показале да људи са наследним дефектима у способности да поправе оштећену ДНК често развију рак и/или развојне абнормалности у раном добу (табела 1). Такви примери пружају снажне доказе који повезују акумулацију оштећења ДНК са људским болестима. Слично, агенси који промовишу пролиферацију ћелија (као што је тетрадеканоилфорбол ацетат) често појачавају карциногенезу. За ова једињења, повећана вероватноћа неопластичне трансформације може бити директна последица смањења времена доступног ћелији да изврши адекватну поправку ДНК.

Табела 1. Наследни поремећаји склони карциному за које се чини да укључују дефекте у поправци ДНК

Најраније теорије о томе како хемикалије интерагују са ДНК могу се пратити до студија спроведених током развоја иперита за употребу у рату. Даље разумевање је произашло из напора да се идентификују агенси против рака који би селективно зауставили репликацију туморских ћелија које се брзо деле. Повећана забринутост јавности због опасности у нашем окружењу подстакла је додатна истраживања механизама и последица хемијске интеракције са генетским материјалом. Примери различитих врста хемикалија које испољавају генотоксичност су представљени у табели 2.

Табела 2. Примери хемикалија које показују генотоксичност у људским ћелијама

Назад

Практично цела медицина је посвећена или спречавању ћелијске смрти, код болести као што су инфаркт миокарда, можданог удара, трауме и шока, или њеном изазивању, као у случају заразних болести и рака. Стога је неопходно разумети природу и механизме који су укључени. Ћелијска смрт је класификована као „случајна“, односно узрокована токсичним агенсима, исхемијом и тако даље, или „програмирана“, као што се дешава током ембриолошког развоја, укључујући формирање цифара и ресорпцију репа пуноглавца.

Повреда ћелије и ћелијска смрт су, стога, важни и у физиологији и у патофизиологији. Физиолошка смрт ћелија је изузетно важна током ембриогенезе и ембрионалног развоја. Проучавање ћелијске смрти током развоја довело је до важних и нових информација о укљученој молекуларној генетици, посебно кроз проучавање развоја бескичмењака. Код ових животиња, прецизна локација и значај ћелија које су предодређене за ћелијску смрт су пажљиво проучаване и, уз коришћење класичних техника мутагенезе, сада је идентификовано неколико укључених гена. Код одраслих органа, равнотежа између ћелијске смрти и пролиферације ћелије контролише величину органа. У неким органима, као што су кожа и црева, постоји непрекидан обрт ћелија. У кожи, на пример, ћелије се диференцирају како стигну до површине и коначно пролазе кроз терминалну диференцијацију и ћелијску смрт док кератинизација наставља са формирањем умрежених омотача.

Многе класе токсичних хемикалија су способне да изазову акутне повреде ћелија праћене смрћу. То укључује аноксију и исхемију и њихове хемијске аналоге као што је калијум цијанид; хемијски карциногени, који формирају електрофиле који се ковалентно везују за протеине у нуклеинским киселинама; оксидативне хемикалије, што доводи до стварања слободних радикала и повреде оксиданса; активација комплемента; и разне калцијум јонофоре. Ћелијска смрт је такође важна компонента хемијске канцерогенезе; многи потпуни хемијски карциногени, у канцерогеним дозама, производе акутну некрозу и упалу праћену регенерацијом и пренеоплазијом.

Дефиниције

Повреда ћелије

Повреда ћелије се дефинише као догађај или стимулус, као што је токсична хемикалија, која ремети нормалну хомеостазу ћелије, изазивајући тако низ догађаја (слика 1). Илустровани главни циљеви смртоносне повреде су инхибиција синтезе АТП-а, поремећај интегритета плазма мембране или повлачење есенцијалних фактора раста.

Слика 1. Повреда ћелије

Смртоносне повреде доводе до смрти ћелије након променљивог временског периода, у зависности од температуре, типа ћелије и стимулуса; или могу бити сублеталне или хроничне – то јест, повреда доводи до измењеног хомеостатског стања које, иако абнормално, не доводи до смрти ћелије (Трамп и Арстила 1971; Трумп и Березески 1992; Трумп и Березески 1995; Трумп, Березески и Осорнио-Варгас 1981). У случају смртоносне повреде, постоји фаза пре времена смрти ћелије

током овог времена, ћелија ће се опоравити; међутим, након одређеног временског периода („тачка без повратка“ или тачка смрти ћелије), уклањање повреде не резултира опоравком, већ уместо тога ћелија пролази кроз деградацију и хидролизу, на крају достижући физичко-хемијску равнотежу са Животна средина. Ово је фаза позната као некроза. Током прелеталне фазе долази до неколико главних типова промена, у зависности од ћелије и врсте повреде. Они су познати као апоптоза и онкоза.

Апоптоза

Апоптоза је изведена из грчких речи или, што значи далеко од, и птосис, што значи пасти. Термин отпадајући од произилази из чињенице да се, током ове врсте прелеталне промене, ћелије смањују и подлежу изразитом мехурићу на периферији. Мехурићи се затим одвајају и испливавају. Апоптоза се јавља у различитим типовима ћелија након различитих врста токсичних повреда (Виллие, Керр и Цуррие 1980). Посебно је изражен у лимфоцитима, где је преовлађујући механизам за промет клонова лимфоцита. Добијени фрагменти резултирају базофилним телима која се виде унутар макрофага у лимфним чворовима. У другим органима, апоптоза се обично јавља у појединачним ћелијама које се брзо уклањају пре и после смрти фагоцитозом фрагмената од стране суседних паренхимских ћелија или макрофага. Апоптоза која се јавља у појединачним ћелијама са накнадном фагоцитозом обично не доводи до упале. Пре смрти, апоптотичке ћелије показују веома густ цитосол са нормалним или кондензованим митохондријама. Ендоплазматски ретикулум (ЕР) је нормалан или само благо проширен. Нуклеарни хроматин је изразито скупљен дуж нуклеарног омотача и око нуклеола. Нуклеарна контура је такође неправилна и долази до нуклеарне фрагментације. Кондензација хроматина је повезана са фрагментацијом ДНК која се, у многим случајевима, дешава између нуклеозома, дајући карактеристичан изглед лествице на електрофорези.

У апоптози, повећана [Ца²⁺]_i може стимулисати К⁺ ефлукс који доводи до смањења ћелија, што вероватно захтева АТП. Повреде које потпуно инхибирају синтезу АТП-а, стога, вероватније ће довести до апоптозе. Константно повећање од [Ца²⁺]_i има низ штетних ефеката укључујући активацију протеаза, ендонуклеаза и фосфолипаза. Активација ендонуклеазе доводи до прекида једноструких и двоструких ланаца ДНК који, заузврат, стимулишу повећане нивое п53 и поли-АДП рибозилацију, као и нуклеарних протеина који су неопходни за поправку ДНК. Активација протеаза модификује бројне супстрате укључујући актин и сродне протеине што доводи до формирања мехурића. Други важан супстрат је поли(АДП-рибоза) полимераза (ПАРП), која инхибира поправку ДНК. Повећана [ца²⁺]_i је такође повезан са активацијом бројних протеин киназа, као што су МАП киназа, калмодулин киназа и друге. Такве киназе су укључене у активацију фактора транскрипције који иницирају транскрипцију непосредно раних гена, на пример, ц-фос, ц-јун и ц-миц, и у активацији фосфолипазе А₂ што резултира пермеабилизацијом плазма мембране и интрацелуларних мембрана као што је унутрашња мембрана митохондрија.

Онкоза

Онкоза, изведена од грчке речи онкос, да отекне, назван је тако јер у овој врсти прелеталне промене ћелија почиње да отиче скоро одмах након повреде (Мајно и Јорис 1995). Разлог за отицање је повећање катјона у води унутар ћелије. Главни одговорни катјон је натријум, који је нормално регулисан за одржавање запремине ћелије. Међутим, у одсуству АТП-а или ако је На-АТПаза плазмалеме инхибирана, контрола запремине се губи због интрацелуларног протеина, а натријум у води наставља да расте. Међу раним догађајима у онкози су, дакле, повећани [На⁺]_i што доводи до ћелијског отока и повећања [Ца²⁺]_i који настају или услед прилива из екстрацелуларног простора или ослобађања из интрацелуларних складишта. То доводи до отицања цитосола, отицања ендоплазматског ретикулума и Голгијевог апарата и формирања водених мехурића око површине ћелије. Митохондрије су у почетку подвргнуте кондензацији, али касније и оне показују отицање велике амплитуде због оштећења унутрашње митохондријалне мембране. У овој врсти прелеталне промене, хроматин се подвргава кондензацији и на крају деградацији; међутим, не види се карактеристична лествица апоптозе.

Некроза

Некроза се односи на низ промена које се јављају након смрти ћелије када се ћелија претвара у остатке који се обично уклањају инфламаторним одговором. Могу се разликовати две врсте: онкотска некроза и апоптотичка некроза. Онкотична некроза се обично јавља у великим зонама, на пример, у инфаркту миокарда или регионално у органу након хемијске токсичности, као што је проксимални тубул бубрега након примене ХгЦл₂. Укључене су широке зоне органа и некротичне ћелије брзо подстичу инфламаторну реакцију, прво акутну, а затим хроничну. У случају да организам преживи, у многим органима некроза је праћена уклањањем мртвих ћелија и регенерацијом, на пример, у јетри или бубрезима након хемијске токсичности. Насупрот томе, апоптотичка некроза се обично јавља на бази једне ћелије и некротични остаци се формирају унутар фагоцита макрофага или суседних паренхимских ћелија. Најраније карактеристике некротичних ћелија укључују прекиде у континуитету плазма мембране и појаву густине флокулента, што представља денатурисане протеине унутар митохондријалног матрикса. Код неких облика повреда који у почетку не ометају акумулацију калцијума у ​​митохондријима, депозити калцијум фосфата се могу видети унутар митохондрија. Други мембрански системи се слично фрагментирају, као што су ЕР, лизозоми и Голгијев апарат. На крају, нуклеарни хроматин се подвргава лизи, што је резултат напада лизозомалних хидролазе. Након смрти ћелије, лизозомалне хидролазе играју важну улогу у чишћењу остатака катепсина, нуклеолаза и липаза, јер оне имају оптимални кисели пХ и могу да преживе низак пХ некротичних ћелија док су други ћелијски ензими денатурисани и инактивирани.

Механизми

Почетни стимулус

У случају смртоносних повреда, најчешће почетне интеракције које доводе до повреде које доводе до смрти ћелије су сметње у енергетском метаболизму, као што су аноксија, исхемија или инхибитори дисања, и гликолиза као што су калијум цијанид, угљен моноксид, јодоацетат и ускоро. Као што је горе поменуто, високе дозе једињења која инхибирају енергетски метаболизам обично доводе до онкозе. Други уобичајени тип почетне повреде која резултира акутном смрћу ћелије је модификација функције плазма мембране (Трумп и Арстила 1971; Трумп, Березески и Осорнио-Варгас 1981). То може бити или директно оштећење и пермеабилизација, као у случају трауме или активације Ц5б-Ц9 комплекса комплемента, механичко оштећење ћелијске мембране или инхибиција натријум-калијума (На⁺-K⁺) пумпа са гликозидима као што је оуабаин. Калцијум јонофори као што су јономицин или А23187, који брзо носе [Ца²⁺] низ градијент у ћелију, такође изазивају акутну смртоносну повреду. У неким случајевима, образац прелеталне промене је апоптоза; код других је онкоза.

Сигнални путеви

Код многих врста повреда, митохондријално дисање и оксидативна фосфорилација су брзо погођени. У неким ћелијама, ово стимулише анаеробну гликолизу, која је способна да одржи АТП, али код многих повреда то је инхибирано. Недостатак АТП-а доводи до неуспеха да се активирају бројни важни хомеостатски процеси, посебно контрола интрацелуларне хомеостазе јона (Трумп и Березески 1992; Трумп, Березески и Осорнио-Варгас 1981). Ово доводи до брзог повећања [Ца²⁺]_i, и повећана [На⁺] и [Цл^-] резултира отицањем ћелија. Повећава [ца²⁺]_i резултирају активацијом низа других сигналних механизама о којима се говори у наставку, укључујући низ киназа, што може резултирати повећаном тренутном раном транскрипцијом гена. Повећана [ца²⁺]_i такође модификује функцију цитоскелета, делом резултирајући формирањем мехурића и активацијом ендонуклеаза, протеаза и фосфолипаза. Чини се да они изазивају многе од важних ефеката о којима је горе дискутовано, као што су оштећење мембране кроз активацију протеазе и липазе, директна деградација ДНК од активације ендонуклеазе и активација киназа као што су МАП киназа и калмодулин киназа, које делују као фактори транскрипције.

Кроз опсежан рад на развоју код бескичмењака Ц. елеганс Дросопхила, као и људске и животињске ћелије, идентификован је низ гена за смрт. Утврђено је да неки од ових гена бескичмењака имају пандане сисара. На пример, ген цед-3, који је неопходан за програмирану ћелијску смрт Ц. елеганс, има активност протеазе и јаку хомологију са ензимом који конвертује интерлеукин сисара (ИЦЕ). Блиско сродни ген који се зове апопаин или прИЦЕ недавно је идентификован са још ближом хомологијом (Ницхолсон ет ал. 1995). Ин Дросопхила, чини се да је ген жетеоца укључен у сигнал који води до програмиране ћелијске смрти. Остали гени за смрт укључују протеин Фас мембране и важан ген супресор тумора, п53, који је широко очуван. п53 се индукује на нивоу протеина након оштећења ДНК и када је фосфорилисан делује као фактор транскрипције за друге гене као што су гадд45 и ваф-1, који су укључени у сигнализацију смрти ћелије. Чини се да су и други непосредни рани гени као што су ц-фос, ц-јун и ц-миц укључени у неке системе.

У исто време, постоје гени против смрти који изгледа да се супротстављају генима за смрт. Први од њих који је идентификован био је цед-9 из Ц. елеганс, који је хомологан бцл-2 код људи. Ови гени делују на још непознат начин да спрече убијање ћелија било генетским или хемијским токсинима. Неки недавни докази указују да бцл-2 може деловати као антиоксиданс. Тренутно се улаже много напора да се развије разумевање укључених гена и да се развију начини за активирање или инхибицију ових гена, у зависности од ситуације.

Назад

Механистичка токсикологија је студија о томе како хемијски или физички агенси интерагују са живим организмима да изазову токсичност. Познавање механизма токсичности неке супстанце побољшава способност спречавања токсичности и дизајнирања пожељнијих хемикалија; представља основу за терапију прекомерног излагања и често омогућава даље разумевање основних биолошких процеса. За потребе овога Енциклопедија нагласак ће бити стављен на животиње да би се предвидела токсичност за људе. Различите области токсикологије укључују механистичку, дескриптивну, регулаторну, форензичку и еколошку токсикологију (Клаассен, Амдур и Доулл 1991). Све ово има користи од разумевања основних механизама токсичности.

Зашто разумети механизме токсичности?

Разумевање механизма којим супстанца изазива токсичност побољшава различите области токсикологије на различите начине. Механистичко разумевање помаже владином регулатору да успостави правно обавезујуће безбедне границе за излагање људи. Помаже токсиколозима у препоруци правца деловања у вези са чишћењем или санацијом контаминираних места и, заједно са физичким и хемијским својствима супстанце или смеше, може се користити за одабир степена потребне заштитне опреме. Механистичко знање је такође корисно у формирању основе за терапију и дизајн нових лекова за лечење људских болести. За форензичког токсиколога механизам токсичности често пружа увид у то како хемијски или физички агенс може изазвати смрт или онеспособљење.

Ако се разуме механизам токсичности, дескриптивна токсикологија постаје корисна у предвиђању токсичних ефеката сродних хемикалија. Важно је схватити, међутим, да недостатак механичких информација не спречава здравствене раднике да заштите људско здравље. Разборите одлуке засноване на студијама на животињама и људском искуству се користе за утврђивање безбедних нивоа изложености. Традиционално, маргина сигурности је утврђена коришћењем „нивоа без штетних ефеката“ или „најнижег нивоа штетних ефеката“ из студија на животињама (користећи дизајне са поновљеном изложеношћу) и дељењем тог нивоа са фактором 100 за професионалну изложеност или 1,000 за друга изложеност људи животне средине. Успех овог процеса је очигледан из неколико инцидената штетних ефеката на здравље који се приписују излагању хемикалијама код радника где су у прошлости постављене и поштоване одговарајуће границе изложености. Поред тога, људски животни век наставља да расте, као и квалитет живота. Свеукупно коришћење података о токсичности довело је до ефикасне регулаторне и добровољне контроле. Детаљно познавање токсичних механизама ће побољшати предвидљивост новијих модела ризика који се тренутно развијају и резултираће сталним побољшањем.

Разумевање механизама животне средине је сложено и претпоставља познавање поремећаја екосистема и хомеостазе (равнотеже). Иако се о томе не говори у овом чланку, боље разумевање токсичних механизама и њихових крајњих последица у екосистему би помогло научницима да донесу мудре одлуке у вези са руковањем комуналним и индустријским отпадом. Управљање отпадом је растућа област истраживања и биће веома важно у будућности.

Технике проучавања механизама токсичности

Већина механичких студија почиње дескриптивном токсиколошком студијом на животињама или клиничким опсервацијама код људи. У идеалном случају, студије на животињама укључују пажљиво понашање и клиничка посматрања, пажљиво биохемијско испитивање елемената крви и урина на знакове штетне функције главних биолошких система у телу и постморталну процену свих система органа микроскопским прегледом да би се проверило да ли постоје повреда (видети смернице ОЕЦД-а за испитивање; директиве ЕЦ о процени хемикалија; правила тестирања ЕПА САД; прописе о хемикалијама Јапана). Ово је аналогно темељном физичком прегледу људи који би се обавио у болници током периода од два до три дана, осим обдукције.

Разумевање механизама токсичности је уметност и наука посматрања, креативност у одабиру техника за тестирање различитих хипотеза и иновативна интеграција знакова и симптома у узрочно-последичној вези. Механистичке студије почињу са излагањем, прате временску дистрибуцију и судбину у телу (фармакокинетика) и мере резултујући токсични ефекат на неком нивоу система и на неком нивоу дозе. Различите супстанце могу деловати на различитим нивоима биолошког система изазивајући токсичност.

Излагање

Пут излагања у механичким студијама је обично исти као код излагања људи. Пут је важан јер могу постојати ефекти који се јављају локално на месту излагања поред системских ефеката након што се хемикалија апсорбује у крв и дистрибуира по целом телу. Једноставан, али убедљив пример локалног ефекта би била иритација и евентуална корозија коже након наношења јаких киселих или алкалних раствора дизајнираних за чишћење тврдих површина. Слично томе, иритација и ћелијска смрт се могу јавити у ћелијама које облажу нос и/или плућа након излагања иритантним парама или гасовима као што су оксиди азота или озона. (Обоје су састојци загађења ваздуха или смога). Након апсорпције хемикалије у крв кроз кожу, плућа или гастроинтестинални тракт, концентрацију у било ком органу или ткиву контролишу многи фактори који одређују фармакокинетику хемикалије у телу. Тело има способност активирања и детоксикације разних хемикалија као што је наведено у наставку.

Улога фармакокинетике у токсичности

Фармакокинетика описује временске односе за хемијску апсорпцију, дистрибуцију, метаболизам (биохемијске промене у телу) и елиминацију или излучивање из тела. У односу на механизме токсичности, ове фармакокинетичке варијабле могу бити веома важне и у неким случајевима одређују да ли ће се токсичност појавити или неће. На пример, ако се материјал не апсорбује у довољној количини, неће доћи до системске токсичности (унутар тела). Супротно томе, високо реактивна хемикалија која се брзо (секунде или минуте) детоксифицира помоћу дигестивних или јетрених ензима можда неће имати времена да изазове токсичност. Неке полицикличне халогенисане супстанце и смеше, као и одређени метали као што је олово, не би изазвали значајну токсичност ако би излучивање било брзо; али акумулација до довољно високих нивоа одређује њихову токсичност пошто излучивање није брзо (понекад се мери годинама). На срећу, већина хемикалија се не задржава тако дуго у телу. Акумулација безопасног материјала и даље не би изазвала токсичност. Брзина елиминације из тела и детоксикације се често назива полуживотом хемикалије, што је време да се 50% хемикалије излучи или промени у нетоксични облик.

Међутим, ако се хемикалија акумулира у одређеној ћелији или органу, то може бити разлог за даље испитивање њене потенцијалне токсичности у том органу. Недавно су развијени математички модели за екстраполацију фармакокинетичких варијабли са животиња на људе. Ови фармакокинетички модели су изузетно корисни у генерисању хипотеза и тестирању да ли експериментална животиња може бити добра репрезентација за људе. О овој теми написана су бројна поглавља и текстови (Гехринг ет ал. 1976; Реитз ет ал. 1987; Нолан ет ал. 1995). Поједностављени пример физиолошког модела је приказан на слици 1.

Слика 1. Поједностављени фармакокинетички модел

Могу негативно утицати на различите нивое и системе

Токсичност се може описати на различитим биолошким нивоима. Повреда се може проценити на целој особи (или животињи), органском систему, ћелији или молекулу. Системи органа обухватају имунолошки, респираторни, кардиоваскуларни, бубрежни, ендокрини, дигестивни, мусколо-скелетни, крвни, репродуктивни и централни нервни систем. Неки кључни органи укључују јетру, бубреге, плућа, мозак, кожу, очи, срце, тестисе или јајнике и друге главне органе. На ћелијском/биохемијском нивоу, нежељени ефекти укључују ометање нормалне функције протеина, функције ендокриних рецептора, инхибицију метаболичке енергије или инхибицију или индукцију ксенобиотских (страних супстанци) ензима. Нежељени ефекти на молекуларном нивоу укључују промену нормалне функције ДНК-РНК транскрипције, специфичног везивања за цитоплазматске и нуклеарне рецепторе и гена или генских производа. На крају, дисфункција у главном органском систему је вероватно узрокована молекуларном променом у одређеној циљној ћелији унутар тог органа. Међутим, није увек могуће пратити механизам уназад до молекуларног порекла узрочности, нити је то неопходно. Интервенција и терапија се могу осмислити без потпуног разумевања молекуларне мете. Међутим, знање о специфичном механизму токсичности повећава предиктивну вредност и тачност екстраполације на друге хемикалије. Слика 2 је дијаграмски приказ различитих нивоа на којима се може открити интерференција нормалних физиолошких процеса. Стрелице показују да се последице по појединца могу одредити одозго надоле (изложеност, фармакокинетика токсичности система/органа) или одоздо према горе (молекуларна промена, ћелијски/биохемијски ефекат до токсичности система/органа).

Слика 2. Репрезентација механизама токсичности

Примери механизама токсичности

Механизми токсичности могу бити једноставни или веома сложени. Често постоји разлика између врсте токсичности, механизма токсичности и нивоа ефекта, у зависности од тога да ли су штетни ефекти последица појединачне, акутне високе дозе (попут случајног тровања) или ниже дозе. поновљено излагање (од професионалне изложености или изложености околини). Класично, у сврху тестирања, акутна, појединачна висока доза се даје директном интубацијом у стомак глодара или излагањем атмосфери гаса или паре у трајању од два до четири сата, шта год највише личи на излагање људи. Животиње се посматрају током периода од две недеље након излагања, а затим се прегледају главни спољни и унутрашњи органи на повреде. Тестирање поновљених доза се креће од месеци до година. За врсте глодара, две године се сматрају хроничном (доживотном) студијом која је довољна за процену токсичности и канцерогености, док би се за нељудске примате две године сматрале субхроничном (мање од животног века) студијом за процену токсичности поновљених доза. Након излагања, врши се комплетан преглед свих ткива, органа и течности како би се утврдили нежељени ефекти.

Механизми акутне токсичности

Следећи примери су специфични за високе дозе, акутне ефекте који могу довести до смрти или тешке онеспособљености. Међутим, у неким случајевима, интервенција ће довести до пролазних и потпуно реверзибилних ефеката. Доза или тежина изложености ће одредити резултат.

Једноставни асфиксанти. Механизам токсичности за инертне гасове и неке друге нереактивне супстанце је недостатак кисеоника (аноксија). Ове хемикалије, које узрокују недостатак кисеоника у централном нервном систему (ЦНС), називају се једноставни асфиксанти. Ако особа уђе у затворени простор који садржи азот без довољно кисеоника, долази до тренутног исцрпљивања кисеоника у мозгу и доводи до несвести и коначне смрти ако се особа брзо не уклони. У екстремним случајевима (близу нулте вредности кисеоника) може доћи до несвести за неколико секунди. Спасавање зависи од брзог уклањања у окружење богато кисеоником. Преживљавање са иреверзибилним оштећењем мозга може настати од одложеног спасавања, због одумирања неурона, који не могу да се регенеришу.

Хемијска средства за гушење. Угљенмоноксид (ЦО) се такмичи са кисеоником за везивање за хемоглобин (у црвеним крвним зрнцима) и стога лишава ткива кисеоника за енергетски метаболизам; може доћи до ћелијске смрти. Интервенција обухвата уклањање са извора ЦО и третман кисеоником. Директна употреба кисеоника заснива се на токсичном деловању ЦО. Још један снажан хемијски гушилац је цијанид. Јон цијанида омета ћелијски метаболизам и коришћење кисеоника за енергију. Третман натријум нитритом изазива промену хемоглобина у црвеним крвним зрнцима у метхемоглобин. Метхемоглобин има већи афинитет везивања за јон цијанида него ћелијска мета цијанида. Сходно томе, метхемоглобин везује цијанид и држи цијанид подаље од циљних ћелија. Ово чини основу за антидоталну терапију.

Депресиви централног нервног система (ЦНС).. Акутну токсичност карактерише седација или губитак свести за низ материјала као што су растварачи који нису реактивни или који се трансформишу у реактивне интермедијере. Претпоставља се да је седација/анестезија последица интеракције растварача са мембранама ћелија у ЦНС-у, што нарушава њихову способност да преносе електричне и хемијске сигнале. Иако седација може изгледати као благи облик токсичности и била је основа за развој раних анестетика, „доза и даље ствара отров”. Ако се довољна доза даје гутањем или удисањем, животиња може угинути услед застоја дисања. Ако не дође до смрти од анестетика, ова врста токсичности је обично лако реверзибилна када се субјект уклони из околине или се хемикалија редистрибуира или елиминише из тела.

Ефекти коже. Штетни ефекти на кожу могу варирати од иритације до корозије, у зависности од супстанце на коју се сусреће. Јаке киселине и алкални раствори су некомпатибилни са живим ткивом и корозивни су, изазивајући хемијске опекотине и могуће ожиљке. Ожиљци настају услед смрти дермалних, дубоких ћелија коже одговорних за регенерацију. Ниже концентрације могу само изазвати иритацију првог слоја коже.

Још један специфичан токсични механизам коже је хемијска сензибилизација. На пример, сензибилизација се јавља када се 2,4-динитрохлоробензен веже са природним протеинима у кожи и имуни систем препознаје измењени комплекс везан за протеине као страни материјал. Реагујући на ову страну материју, имуни систем активира посебне ћелије да елиминишу страну супстанцу ослобађањем медијатора (цитокина) који изазивају осип или дерматитис (погледајте „Имунотоксикологију“). Ово је иста реакција имуног система када дође до излагања отровном бршљану. Имунолошка сензибилизација је веома специфична за одређену хемикалију и потребна је најмање два излагања пре него што се изазове одговор. Прво излагање сензибилизира (подешава ћелије да препознају хемикалију), а накнадно излагање покреће одговор имуног система. Уклањање контакта и симптоматска терапија антиинфламаторним кремама које садрже стероиде обично су ефикасне у лечењу сензибилизованих појединаца. У озбиљним или рефракторним случајевима, системски делујући имуносупресив попут преднизона користи се у комбинацији са локалним лечењем.

Сензибилизација плућа. Толуен диизоцијанат (ТДИ) изазива имуни одговор на сензибилизацију, али циљно место су плућа. Прекомерно излагање ТДИ код осетљивих особа изазива едем плућа (нагомилавање течности), бронхијално стезање и оштећење дисања. Ово је озбиљно стање и захтева уклањање појединца из потенцијалног накнадног излагања. Лечење је првенствено симптоматско. Сензибилизација коже и плућа прати одговор на дозу. Прекорачење нивоа одређеног за професионалну изложеност може изазвати штетне ефекте.

Ефекти ока. Повреда ока се креће од црвенила спољашњег слоја (црвенило у базену) преко формирања катаракте на рожњачи до оштећења шаренице (обојени део ока). Тестови иритације очију се спроводе када се верује да неће доћи до озбиљне повреде. Многи механизми који изазивају корозију коже такође могу изазвати повреду очију. Материјали корозивни за кожу, попут јаких киселина (пХ мањи од 2) и алкалија (пХ већи од 11.5), нису тестирани у очима животиња јер ће већина изазвати корозију и слепило због механизма сличног оном који изазива корозију коже . Поред тога, површински активни агенси попут детерџената и сурфактаната могу изазвати повреде ока у распону од иритације до корозије. Група материјала која захтева опрез су позитивно наелектрисани (катјонски) сурфактанти, који могу изазвати опекотине, трајно замућење рожњаче и васкуларизацију (формирање крвних судова). Друга хемикалија, динитрофенол, има специфичан ефекат стварања катаракте. Чини се да је ово повезано са концентрацијом ове хемикалије у оку, што је пример фармакокинетичке дистрибуционе специфичности.

Иако је горенаведена листа далеко од исцрпне, она је дизајнирана да пружи читаоцу уважавање различитих механизама акутне токсичности.

Механизми субхроничне и хроничне токсичности

Када се дају као појединачна висока доза, неке хемикалије немају исти механизам токсичности као када се дају више пута као нижа, али и даље токсична доза. Када се даје једна велика доза, увек постоји могућност да се прекорачи способност особе да детоксикује или излучи хемикалију, а то може довести до другачијег токсичног одговора него када се дају мање дозе које се понављају. Алкохол је добар пример. Високе дозе алкохола доводе до примарних ефеката на централни нервни систем, док мање дозе које се понављају доводе до повреде јетре.

Инхибиција антихолинестеразе. Већина органофосфатних пестицида, на пример, има малу токсичност за сисаре док се метаболички не активирају, првенствено у јетри. Примарни механизам деловања органофосфата је инхибиција ацетилхолинестеразе (АЦхЕ) у мозгу и периферном нервном систему. АЦхЕ је нормални ензим који прекида стимулацију неуротрансмитера ацетилхолина. Лагана инхибиција АЦхЕ током дужег периода није повезана са нежељеним ефектима. При високим нивоима изложености, немогућност да се прекине ова неуронска стимулација доводи до прекомерне стимулације холинергичког нервног система. Холинергична прекомерна стимулација на крају доводи до низа симптома, укључујући респираторни застој, праћен смрћу ако се не лечи. Примарни третман је примена атропина, који блокира ефекте ацетилхолина, и примена пралидоксим хлорида, који реактивира инхибирани АЦхЕ. Стога се и узрок и третман токсичности органофосфата разматрају разумевањем биохемијске основе токсичности.

Метаболичка активација. Многе хемикалије, укључујући угљен-тетрахлорид, хлороформ, ацетиламинофлуорен, нитрозамине и паракват се метаболички активирају до слободних радикала или других реактивних интермедијера који инхибирају и ометају нормалну ћелијску функцију. При високим нивоима изложености ово доводи до смрти ћелије (погледајте „Повреда ћелије и ћелијска смрт“). Док специфичне интеракције и ћелијски циљеви остају непознати, системи органа који имају способност да активирају ове хемикалије, као што су јетра, бубрези и плућа, су потенцијалне мете за повреде. Конкретно, одређене ћелије унутар органа имају већи или мањи капацитет да активирају или детоксикују ове интермедијере, а овај капацитет одређује интрацелуларну осетљивост унутар органа. Метаболизам је један од разлога зашто је разумевање фармакокинетике, која описује ове врсте трансформација и дистрибуцију и елиминацију ових интермедијера, важно за препознавање механизма деловања ових хемикалија.

Механизми рака. Рак је мноштво болести, и док се разумевање одређених врста рака убрзано повећава због многих молекуларно биолошких техника које су развијене од 1980. године, има још много тога да се научи. Међутим, јасно је да је развој рака процес у више фаза, а критични гени су кључни за различите врсте рака. Промене у ДНК (соматске мутације) у великом броју ових критичних гена могу изазвати повећану осетљивост или канцерогене лезије (погледајте „Генетичка токсикологија”). Изложеност природним хемикалијама (у куваној храни попут говедине и рибе) или синтетичким хемикалијама (као што је бензидин, који се користи као боја) или физичким агенсима (ултраљубичасто светло од сунца, радон из земље, гама зрачење из медицинских процедура или индустријских активности) су све доприносе мутацијама соматских гена. Међутим, постоје природне и синтетичке супстанце (као што су антиоксиданти) и процеси поправке ДНК који штите и одржавају хомеостазу. Јасно је да је генетика важан фактор у настанку рака, пошто синдроми генетских болести као што је пигментна ксеродерма, где постоји недостатак нормалне поправке ДНК, драматично повећавају осетљивост на рак коже услед излагања ултраљубичастом зрачењу сунца.

Репродуктивни механизми. Слично као код рака, познати су многи механизми репродуктивне и/или развојне токсичности, али много тога треба научити. Познато је да ће одређени вируси (као што је рубеола), бактеријске инфекције и лекови (као што су талидомид и витамин А) негативно утицати на развој. Недавно, рад Кхере (1991), који је прегледао Царнеи (1994), показује добре доказе да се абнормални развојни ефекти у тестовима на животињама са етилен гликолом могу приписати метаболичким метаболитима код мајке. Ово се дешава када се етилен гликол метаболише у киселе метаболите укључујући гликолну и оксалну киселину. Чини се да су накнадни ефекти на плаценту и фетус последица овог процеса метаболичке токсичности.

Zakljucak

Намера овог чланка је да пружи перспективу о неколико познатих механизама токсичности и потреби за будућом студијом. Важно је схватити да механичко знање није апсолутно неопходно за заштиту здравља људи или животне средине. Ово знање ће побољшати способност стручњака да боље предвиди и управља токсичношћу. Стварне технике које се користе у разјашњавању било ког посебног механизма зависе од колективног знања научника и размишљања оних који доносе одлуке у вези са људским здрављем.

Назад