Људски биолошки мониторинг користи узорке телесних течности или другог биолошког материјала који се лако може добити за мерење изложености специфичним или неспецифичним супстанцама и/или њиховим метаболитима или за мерење биолошких ефеката ове изложености. Биолошко праћење омогућава да се процени укупна индивидуална изложеност кроз различите путеве изложености (плућа, кожа, гастроинтестинални тракт) и различите изворе изложености (ваздух, исхрана, начин живота или занимање). Такође је познато да у сложеним ситуацијама изложености, које се врло често сусрећу на радним местима, различити агенси за излагање могу да ступају у интеракцију једни са другима, или појачавају или инхибирају ефекте појединачних једињења. А пошто се појединци разликују по својој генетској конституцији, они показују варијабилност у свом одговору на излагање хемикалијама. Стога би могло бити разумније тражити ране ефекте директно код изложених појединаца или група него покушавати да предвиди потенцијалне опасности сложених образаца изложености на основу података који се односе на појединачна једињења. Ово је предност генетског биомониторинга за ране ефекте, приступа који користи технике које се фокусирају на цитогенетско оштећење, тачкасте мутације или адукте ДНК у сурогатном људском ткиву (погледајте чланак „Општи принципи“ у овом поглављу).

Шта је генотоксичност?

Генотоксичност хемијских агенаса је суштински хемијски карактер, заснован на електрофилном потенцијалу агенса да се веже са таквим нуклеофилним местима у ћелијским макромолекулима као што је дезоксирибонуклеинска киселина, ДНК, носилац наследне информације. Генотоксичност је, дакле, токсичност која се манифестује у генетском материјалу ћелија.

Дефиниција генотоксичности, како је дискутовано у консензусном извештају (ИАРЦ 1992), је широка и укључује директне и индиректне ефекте у ДНК: (1) индукцију мутација (генских, хромозомских, геномских, рекомбинационих) које на молекуларном нивоу су слични догађајима за које се зна да су укључени у карциногенезу, (2) индиректни сурогат догађаји повезани са мутагенезом (нпр. непланирана синтеза ДНК (УДС) и размена сестринских хроматида (СЦЕ), или (3) оштећење ДНК (нпр. формирање адуката) ), што на крају може довести до мутација.

Генотоксичност, мутагеност и карциногеност

Мутације су трајне наследне промене у ћелијским линијама, било хоризонтално у соматским ћелијама или вертикално у заметним (полним) ћелијама тела. Односно, мутације могу утицати на сам организам кроз промене у телесним ћелијама, или се могу пренети на друге генерације кроз промену полних ћелија. Генотоксичност стога претходи мутагености, иако се већина генотоксичности поправља и никада се не изражава као мутације. Соматске мутације се индукују на ћелијском нивоу и у случају да доведу до ћелијске смрти или малигнитета, могу се манифестовати као различити поремећаји ткива или самог организма. Сматра се да су соматске мутације повезане са ефектима старења или са индукцијом атеросклеротских плакова (видети слику 1 и поглавље о Рак).

Слика 1. Шематски приказ научне парадигме у генетској токсикологији и утицајима на здравље људи

Мутације у линији заметних ћелија могу се пренети у зиготу — оплођену јајну ћелију — и изразити се у генерацији потомака (видети такође поглавље Репродуктивни систем). Најважнији мутациони поремећаји пронађени код новорођенчета изазвани су малсегрегацијом хромозома током гаметогенезе (развој заметних ћелија) и резултирају тешким хромозомским синдромима (нпр. тризомија 21 или Даунов синдром и монозомија Кс или Тарнеров синдром).

Парадигма генотоксикологије од изложености до очекиваних ефеката може се поједноставити као што је приказано на слици 1.

Однос генотоксичности и канцерогености је добро подржан разним индиректним истраживачким чињеницама, као што је приказано на слици 2. 

Слика 2. Међуодноси генотоксичности и канцерогености    

Ова корелација пружа основу за примену биомаркера генотоксичности који ће се користити у праћењу људи као индикатора опасности од рака.

Генетска токсичност у идентификацији опасности

Улога генетских промена у карциногенези наглашава важност тестирања генетичке токсичности у идентификацији потенцијалних канцерогена. Развијене су различите краткорочне методе испитивања које су у стању да открију неке од крајњих тачака генотоксичности које су наводно релевантне за карциногенезу.

Извршено је неколико опсежних истраживања како би се упоредила канцерогеност хемикалија са резултатима добијеним њиховим испитивањем у краткорочним тестовима. Општи закључак је да пошто ниједан валидирани тест не може пружити информације о свим горе наведеним генетским крајњим тачкама; потребно је тестирати сваку хемикалију у више од једног теста. Такође, више пута је дискутована и разматрана вредност краткорочних тестова генетске токсичности за предвиђање хемијске канцерогености. На основу таквих прегледа, радна група Међународне агенције за истраживање рака (ИАРЦ) закључила је да већина људских канцерогена даје позитивне резултате у рутински коришћеним краткотрајним тестовима као што је Салмонела тест и тестови хромозомских аберација (табела 1). Међутим, мора се схватити да се епигенетски карциногени — као што су хормонски активна једињења која могу повећати генотоксичну активност, а да сами нису генотоксични — не могу открити краткорочним тестовима, који мере само интринзичну генотоксичну активност супстанце.

Табела 1. Генотоксичност хемикалија процењена у додацима 6 и 7 монографијама ИАРЦ (1986)

Генетски биомониторинг

Генетски мониторинг користи методе генетске токсикологије за биолошко праћење генетских ефеката или процену изложености генотоксичности у групи појединаца са дефинисаном изложеношћу на радном месту или кроз животну средину или начин живота. Дакле, генетски мониторинг има потенцијал за рану идентификацију изложености генотоксичности у групи особа и омогућава идентификацију високоризичних популација, а тиме и приоритета за интервенцију. Употреба предиктивних биомаркера у изложеној популацији је оправдана да би се уштедело време (у поређењу са епидемиолошким техникама) и да би се спречили непотребни крајњи ефекти, односно рак (слика 3).

Слика 3. Предиктивност биомаркера омогућава предузимање превентивних радњи за смањење ризика по здравље у људској популацији

Методе које се тренутно користе за биомониторинг излагања генотоксичности и раних биолошких ефеката наведене су у табели 2. Узорци који се користе за биомониторинг морају испунити неколико критеријума, укључујући и неопходност да буду лако доступни и упоредиви са циљним ткивом.

Табела 2. Биомаркери у генетском праћењу изложености генотоксичности и најчешће коришћени узорци ћелија/ткива.

Типови молекуларно препознатљивих оштећења ДНК укључују формирање ДНК адуката и реорганизацију ДНК секвенце. Ове врсте оштећења могу се открити мерењем ДНК адуката коришћењем различитих техника, на пример, било 32П-постобележавање или детекција моноклонских антитела на адукте ДНК. Мерење прекида ДНК ланца се конвенционално спроводи коришћењем алкалне елуције или тестова одмотавања. Мутације се могу открити секвенцирањем ДНК специфичног гена, на пример, ХПРТ гена.

Појавило се неколико методолошких извештаја који детаљно разматрају технике из табеле 2 (ЦЕЦ 1987; ИАРЦ 1987, 1992, 1993).

Генотоксичност се може пратити и индиректно мерењем протеинских адуката, односно у хемоглобину уместо ДНК, или праћењем активности поправке ДНК. Као стратегија мерења, активност праћења може бити једнократна или континуирана. У свим случајевима резултати се морају применити на развој безбедних услова рада.

Цитогенетиц Биомониторинг

Теоријско и емпиријско образложење повезује рак са оштећењем хромозома. Догађаји мутације који мењају активност или експресију гена фактора раста су кључни кораци у карциногенези. Многе врсте карцинома су повезане са специфичним или неспецифичним хромозомским аберацијама. Код неколико наследних људских болести, нестабилност хромозома је повезана са повећаном осетљивошћу на рак.

Цитогенетски надзор људи изложених канцерогеним и/или мутагеним хемикалијама или зрачењу може открити ефекте на генетски материјал дотичних појединаца. Студије хромозомских аберација људи изложених јонизујућем зрачењу деценијама се примењују за биолошку дозиметрију, али су добро документовани позитивни резултати још увек доступни само за ограничен број хемијских канцерогена.

Микроскопски препознатљиво хромозомско оштећење обухвата како структурне хромозомске аберације (ЦА), у којима је дошло до грубе промене у морфологији (облика) хромозома, тако и измене сестринских хроматида (СЦЕ). СЦЕ је симетрична размена хромозомских материјала између две сестринске хроматиде. Микронуклеуси (МН) могу настати или из ацентричних фрагмената хромозома или из целих хромозома који заостају. Ове врсте промена су илустроване на слици 4.

Слика 4. Хромозоми хуманих лимфоцита у метафази, откривајући индуковану мутацију хромозома (стрелица која показује на ацентрични фрагмент)

Лимфоцити периферне крви код људи су погодне ћелије за употребу у надзорним студијама због њихове лаке доступности и зато што могу да интегришу изложеност током релативно дугог животног века. Изложеност разним хемијским мутагенима може довести до повећања учесталости ЦА и/или СЦЕ у лимфоцитима крви изложених особа. Такође, степен оштећења је у грубој корелацији са изложеношћу, иако је то показано са само неколико хемикалија.

Када цитогенетски тестови на лимфоцитима периферне крви покажу да је генетски материјал оштећен, резултати се могу користити за процену ризика само на нивоу популације. Повећана учесталост ЦА у популацији треба сматрати индикацијом повећаног ризика од рака, али цитогенетски тестови као такви не дозвољавају индивидуално предвиђање ризика од рака.

Здравствени значај соматских генетских оштећења како се види кроз уски прозор узорка лимфоцита периферне крви има мали или никакав значај за здравље појединца, пошто већина лимфоцита који носе генетско оштећење умире и бивају замењени.

Проблеми и њихова контрола у студијама хуманог биомониторинга

Ригорозан дизајн студије је неопходан у примени било које методе људског биомониторинга, пошто многи интериндивидуални фактори који нису повезани са специфичном(им) хемикалијом(има) од интереса могу утицати на проучаване биолошке одговоре. Пошто су студије људског биомониторинга заморне и тешке у многим аспектима, пажљиво планирање унапред је веома важно. У извођењу хуманих цитогенетских студија, експериментална потврда потенцијала оштећења хромозома агенса(а) излагања увек треба да буде експериментални предуслов.

У студијама цитогенетског биомониторинга, документована су два главна типа варијација. Први укључује техничке факторе повезане са разликама у очитавању слајдова и условима културе, посебно са врстом медијума, температуром и концентрацијом хемикалија (као што су бромодеоксиуридин или цитохалазин-Б). Такође, времена узорковања могу да промене приносе хромозомских аберација, а могуће и налазе инциденције СЦЕ, кроз промене у субпопулацијама Т- и Б-лимфоцита. У микронуклеусним анализама, методолошке разлике (нпр. употреба бинуклеираних ћелија индукованих цитохаласином-Б) прилично јасно утичу на резултате бодовања.

Лезије изазване у ДНК лимфоцита хемијским излагањем које доводе до формирања структурних хромозомских аберација, размене сестринских хроматида и микронуклеуса морају да опстану. ин виво док се крв не повуче а затим ин витро све док култивисани лимфоцит не започне синтезу ДНК. Стога је важно да се ћелије оцењују непосредно после прве деобе (у случају хромозомских аберација или микронуклеуса) или после друге деобе (сестринске размене хроматида) како би се добила најбоља процена индукованог оштећења.

Бодовање представља изузетно важан елемент у цитогенетском биомониторингу. Слајдови морају бити насумично распоређени и кодирани да би се избегла пристрасност стрелца колико год је то могуће. Треба одржавати доследне критеријуме за бодовање, контролу квалитета и стандардизоване статистичке анализе и извештавање. Друга категорија варијабилности је због стања повезаних са субјектима, као што су старост, пол, лекови и инфекције. Појединачне варијације такође могу бити узроковане генетском осетљивошћу на агенсе из животне средине.

Од кључне је важности да се добије истовремена контролна група која је што је могуће ближа у складу са унутрашњим факторима као што су пол и године, као и фактори као што су пушачки статус, вирусне инфекције и вакцинације, унос алкохола и дрога и излагање рендгенским зрацима. . Поред тога, потребно је добити квалитативне (категорија посла, године изложености) и квантитативне (нпр. узорци ваздуха у зони дисања за хемијску анализу и специфични метаболити, ако је могуће) процене или изложеност наводним генотоксичним агенсима на радном месту. Посебну пажњу треба посветити правилном статистичком третману резултата.

Релевантност генетског биомониторинга за процену ризика од рака

Број агенаса за које се више пута показало да изазивају цитогенетске промене код људи је још увек релативно ограничен, али већина познатих канцерогена изазива оштећења у хромозомима лимфоцита.

Обим оштећења је функција нивоа изложености, као што се показало да је случај са, на пример, винил хлоридом, бензолом, етилен оксидом и алкилирајућим агенсима против рака. Чак и ако цитогенетичке крајње тачке нису веома осетљиве или специфичне у погледу откривања изложености која се јавља у данашњим радним окружењима, позитивни резултати таквих тестова често су подстакли спровођење хигијенских контрола чак и у одсуству директних доказа који се односе на соматско хромозомско оштећење неповољни здравствени исходи.

Већина искуства са применом цитогенетског биомониторинга потиче из професионалних ситуација „високе изложености“. Неколико независних студија је потврдило врло мало излагања, а већина њих је изведена коришћењем биомониторинга хромозомских аберација. База података Међународне агенције за истраживање рака наводи у својим ажурираним томовима 43–50 монографија ИАРЦ-а укупно 14 професионалних канцерогена у групама 1, 2А или 2Б, за које постоје позитивни цитогенетички подаци људи који су у већини случајева доступни. подржано одговарајућом животињском цитогенетиком (табела 3). Ова ограничена база података сугерише да постоји тенденција да канцерогене хемикалије буду кластогене и да се кластогеност повезује са познатим људским канцерогенима. Сасвим је јасно, међутим, да сви карциногени не изазивају цитогенетско оштећење код људи или експерименталних животиња ин виво. Случајеви у којима су подаци на животињама позитивни, а налази код људи негативни могу представљати разлике у нивоима изложености. Такође, сложена и дуготрајна изложеност људи на послу можда неће бити упоредива са краткорочним експериментима на животињама.

Табела 3. Доказани, вероватни и могући карциногени код људи за које постоји професионална изложеност и за које су мерене цитогенетске крајње тачке и код људи и код експерименталних животиња

¹ ЦА, хромозомска аберација; СЦЕ, размена сестринских хроматида; МН, микронуклеуси.
(–) = негативна веза за једну студију; – = негативна веза;
(+) = позитивна веза за једну студију; + = позитиван однос;
? = неуверљиво; празна област = није проучавана

Извор: ИАРЦ, 1987; ажуриран кроз томове 43–50 монографија ИАРЦ.

Студије генотоксичности код изложених људи укључују различите крајње тачке осим хромозомских крајњих тачака, као што су оштећење ДНК, активност поправке ДНК и адукти у ДНК и у протеинима. Неке од ових крајњих тачака могу бити релевантније од других за предвиђање канцерогене опасности. Стабилне генетске промене (нпр. хромозомска преуређивања, делеције и тачкасте мутације) су веома релевантне, пошто је познато да су ове врсте оштећења повезане са карциногенезом. Значај ДНК адуката зависи од њихове хемијске идентификације и доказа да су резултат излагања. Неке крајње тачке, као што су СЦЕ, УДС, ССБ, ломљење ланца ДНК, потенцијални су индикатори и/или маркери генетских догађаја; међутим, њихова вредност је смањена у одсуству механичког разумевања њихове способности да доведу до генетских догађаја. Јасно је да би најрелевантнији генетски маркер код људи био индукција специфичне мутације која је директно повезана са раком код глодара изложених агенсу који се проучава (слика 5).

Слика 5. Релевантност различитих ефеката генетског биомониторинга за потенцијални ризик од рака

Етичка разматрања за генетски биомониторинг

Брзи напредак у молекуларно-генетским техникама, повећана брзина секвенцирања људског генома и идентификација улоге гена супресора тумора и протоонкогена у хуманој карциногенези, постављају етичка питања у тумачењу, комуникацији и употреби ове врсте лична информација. Брзо побољшање техника за анализу људских гена ће ускоро омогућити идентификацију још више наследних гена осетљивости код здравих, асимптоматских појединаца (УС Оффице оф Тецхнологи Ассессмент 1990), који ће се моћи користити у генетском скринингу.

Многа питања од друштвеног и етичког значаја биће покренута ако примена генетског скрининга ускоро постане стварност. Већ сада се сумња да је око 50 генетских особина метаболизма, полиморфизама ензима и поправке ДНК због осетљивости на специфичне болести, а дијагностички ДНК тест је доступан за око 300 генетских болести. Да ли би било какав генетски скрининг уопште требало да се обавља на радном месту? Ко ће одлучити ко ће бити подвргнут тестирању и како ће се информације користити у одлукама о запошљавању? Ко ће имати приступ информацијама добијеним генетским скринингом и како ће резултати бити саопштени укљученој особи (особама)? Многа од ових питања су снажно повезана са друштвеним нормама и преовлађујућим етичким вредностима. Главни циљ мора бити превенција болести и људске патње, али поштовање сопствене воље и етичких премиса појединца мора бити уважено. Нека од релевантних етичких питања на која се мора одговорити много пре почетка било које студије о биомониторингу на радном месту дата су у табели 4 и такође се разматрају у поглављу Етичка питања.

Табела 4. Неки етички принципи који се односе на потребу да се зна у професионалним генетским биомониторинг студијама

Време и труд се морају уложити у фазу планирања било које студије генетског биомониторинга, а све потребне стране – запослени, послодавци и медицинско особље на радном месту које сарађује – морају бити добро информисани пре студије, а резултати морају бити познати њих и после студија. Уз одговарајућу негу и поуздане резултате, генетски биомониторинг може помоћи да се осигурају безбеднија радна места и побољша здравље радника.

Назад