- Ви сте овде:
-
Početna
-
ИВ део. Алати и приступи
-
Токицологи
- Токсиколошке методе испитивања
Токсиколошке методе испитивања
Биомаркери
Реч биомаркер је скраћеница за биолошки маркер, термин који се односи на мерљиви догађај који се дешава у биолошком систему, као што је људско тело. Овај догађај се онда тумачи као одраз, или маркер, општијег стања организма или очекиваног животног века. У здравству на раду, биомаркер се генерално користи као индикатор здравственог статуса или ризика од болести.
Биомаркери се користе за ин витро као и за ин виво студије које могу укључивати људе. Обично се идентификују три специфичне врсте биолошких маркера. Иако је неколико биомаркера тешко класификовати, они се обично деле на биомаркере изложености, биомаркере ефекта или биомаркере осетљивости (видети табелу 1).
Табела 1. Примери биомаркера изложености или биомаркера ефеката који се користе у токсиколошким студијама у здрављу на раду
| Узорак | Мера | Намена |
| Биомаркери изложености | ||
| Масно ткиво | Диоксин | Излагање диоксину |
| Крв | Довести | Изложеност олову |
| кост | Алуминијум | Излагање алуминијуму |
| Издахнути дах | Толуен | Излагање толуену |
| коса | Меркур | Излагање метилживи |
| Серум | Бензен | Изложеност бензену |
| Урин | Фенол | Изложеност бензену |
| Биомаркери ефекта | ||
| Крв | карбоксихемоглобин | Изложеност угљен моноксиду |
| Црвена крвна зрнца | Цинк-протопорфирин | Изложеност олову |
| Серум | Холинестераза | Излагање органофосфату |
| Урин | Мицроглобулинс | Нефротоксично излагање |
| бела крвна зрнца | ДНК адукти | Излагање мутагенима |
Уз прихватљив степен ваљаности, биомаркери се могу користити у неколико намена. На индивидуалној основи, биомаркер се може користити да подржи или оповргне дијагнозу одређене врсте тровања или другог хемијски изазваног нежељеног ефекта. Код здравог субјекта, биомаркер такође може одражавати индивидуалну хиперсклоност специфичним хемикалијама и стога може послужити као основа за предвиђање ризика и саветовање. У групама изложених радника, неки биомаркери изложености могу се применити за процену степена усклађености са прописима о смањењу загађења или ефикасности превентивних напора уопште.
Биомаркери изложености
Биомаркер изложености може бити егзогено једињење (или метаболит) у телу, интерактивни производ између једињења (или метаболита) и ендогене компоненте, или други догађај повезан са изложеношћу. Најчешће, биомаркери изложености стабилним једињењима, као што су метали, обухватају мерења концентрација метала у одговарајућим узорцима, као што су крв, серум или урин. Код испарљивих хемикалија може се проценити њихова концентрација у издахнутом даху (након удисања ваздуха без контаминације). Ако се једињење метаболише у телу, један или више метаболита се може изабрати као биомаркер изложености; метаболити се често одређују у узорцима урина.
Савремене методе анализе могу омогућити раздвајање изомера или конгенера органских једињења, као и одређивање специјације металних једињења или изотопских односа појединих елемената. Софистициране анализе омогућавају одређивање промена у структури ДНК или других макромолекула изазваних везивањем са реактивним хемикалијама. Такве напредне технике ће без сумње значајно добити на значају за апликације у студијама биомаркера, а ниже границе детекције и боља аналитичка валидност ће вероватно учинити ове биомаркере још кориснијим.
Посебно обећавајући развој догодио се са биомаркерима изложености мутагеним хемикалијама. Ова једињења су реактивна и могу да формирају адукте са макромолекулима, као што су протеини или ДНК. Адукти ДНК могу се открити у белим крвним зрнцима или биопсијама ткива, а специфични фрагменти ДНК могу се излучити урином. На пример, излагање етилен оксиду доводи до реакција са ДНК базама, и, након ексцизије оштећене базе, Н-7-(2-хидроксиетил)гванин ће се елиминисати у урину. Неки адукти се можда не односе директно на одређену изложеност. На пример, 8-хидрокси-2´-деоксигуанозин одражава оксидативно оштећење ДНК, а ову реакцију може покренути неколико хемијских једињења, од којих већина такође индукује пероксидацију липида.
Други макромолекули се такође могу променити формирањем или оксидацијом адукта. Од посебног интереса, таква реактивна једињења могу да генеришу адукте хемоглобина који се могу одредити као биомаркери изложености једињењима. Предност је у томе што се из узорка крви могу добити велике количине хемоглобина, а с обзиром на четворомесечни животни век црвених крвних зрнаца, адукти формирани са амино киселинама протеина ће указивати на укупну изложеност током овог периода.
Адукти се могу одредити осетљивим техникама као што је липидна хроматографија високих перформанси, а доступне су и неке имунолошке методе. Генерално, аналитичке методе су нове, скупе и захтевају даљи развој и валидацију. Боља осетљивост се може постићи коришћењем 32П тест обележавања након обележавања, што је неспецифична индикација да је дошло до оштећења ДНК. Све ове технике су потенцијално корисне за биолошки мониторинг и примењене су у све већем броју студија. Међутим, потребне су једноставније и осетљивије аналитичке методе. С обзиром на ограничену специфичност неких метода при ниском излагању, пушење дувана или други фактори могу значајно да утичу на резултате мерења, узрокујући потешкоће у интерпретацији.
Изложеност мутагеним једињењима, или једињењима која се метаболишу у мутагене, такође се може утврдити проценом мутагености урина изложене особе. Узорак урина се инкубира са сојем бактерија код којих је специфична тачкаста мутација изражена на начин који се лако може измерити. Ако су мутагене хемикалије присутне у узорку урина, онда ће се у бактеријама појавити повећана стопа мутација.
Биомаркери изложености се морају проценити с обзиром на временске варијације у изложености и однос према различитим одељцима. Дакле, временски оквир(и) представљени биомаркером, односно степен у коме мерење биомаркера одражава прошлу изложеност(е) и/или акумулирани терет тела, мора да се одреди из токсикокинетичких података да би се резултат интерпретирао. Посебно треба узети у обзир степен до којег биомаркер указује на задржавање у одређеним циљним органима. Иако се узорци крви често користе за студије биомаркера, периферна крв се генерално не сматра преградом као таквом, иако делује као транспортни медијум између одељења. Степен до којег концентрација у крви одражава нивое у различитим органима увелико варира између различитих хемикалија, а обично зависи и од дужине излагања, као и од времена од излагања.
Понекад се ова врста доказа користи за класификацију биомаркера као индикатора (укупне) апсорбоване дозе или индикатора ефективне дозе (тј. количине која је достигла циљно ткиво). На пример, излагање одређеном растварачу може се проценити на основу података о стварној концентрацији растварача у крви у одређено време након излагања. Ово мерење ће одражавати количину растварача који је апсорбован у тело. Део апсорбоване количине ће бити издахнут услед притиска паре растварача. Док циркулише у крви, растварач ће ступити у интеракцију са различитим компонентама тела и на крају ће постати подложан разградњи ензима. Исход метаболичких процеса може се проценити одређивањем специфичних меркаптурних киселина произведених коњугацијом са глутатионом. Кумулативно излучивање меркаптурних киселина може боље да одражава ефективну дозу него концентрација у крви.
Животни догађаји, као што су репродукција и старење, могу утицати на дистрибуцију хемикалије. Трудноћа значајно утиче на дистрибуцију хемикалија у телу, а многе хемикалије могу проћи плацентну баријеру, изазивајући излагање фетуса. Лактација може довести до излучивања хемикалија растворљивих у липидима, што доводи до смањеног задржавања код мајке заједно са повећаним уносом одојчета. Током губитка тежине или развоја остеопорозе, ускладиштене хемикалије се могу ослободити, што онда може довести до обновљеног и продуженог „ендогеног“ излагања циљних органа. Други фактори могу утицати на индивидуалну апсорпцију, метаболизам, задржавање и дистрибуцију хемијских једињења, а доступни су и неки биомаркери осетљивости (види доле).
Биомаркери ефекта
Маркер ефекта може бити ендогена компонента, или мера функционалног капацитета, или неки други индикатор стања или равнотеже тела или система органа, на који утиче изложеност. Такви маркери ефекта су генерално претклинички индикатори абнормалности.
Ови биомаркери могу бити специфични или неспецифични. Специфични биомаркери су корисни јер указују на биолошки ефекат одређене изложености, чиме се пружају докази који се потенцијално могу користити у превентивне сврхе. Неспецифични биомаркери не указују на појединачни узрок ефекта, али могу одражавати укупан, интегрисани ефекат због мешовите изложености. Обе врсте биомаркера стога могу бити од велике користи у здрављу на раду.
Не постоји јасна разлика између биомаркера изложености и биомаркера ефекта. На пример, могло би се рећи да формирање адукта одражава ефекат пре него излагање. Међутим, биомаркери ефекта обично указују на промене у функцијама ћелија, ткива или целог тела. Неки истраживачи укључују велике промене, као што је повећање тежине јетре изложених лабораторијских животиња или смањен раст код деце, као биомаркере ефекта. У сврху здравља на раду, биомаркери ефекта треба да буду ограничени на оне који указују на субклиничке или реверзибилне биохемијске промене, као што је инхибиција ензима. Најчешћи биомаркер ефекта је вероватно инхибиција холинестеразе коју изазивају одређени инсектициди, односно органофосфати и карбамати. У већини случајева, овај ефекат је потпуно реверзибилан, а инхибиција ензима одражава укупну изложеност овој одређеној групи инсектицида.
Нека излагања не доводе до инхибиције ензима, већ до повећане активности ензима. Ово је случај са неколико ензима који припадају породици П450 (погледајте „Генетске детерминанте токсичног одговора”). Они могу бити изазвани излагањем одређеним растварачима и полиароматичним угљоводоницима (ПАХ). Пошто се ови ензими углавном експримирају у ткивима из којих је тешко добити биопсију, активност ензима се одређује индиректно ин виво давањем једињења које се метаболише тим одређеним ензимом, а затим се производ разградње мери у урину или плазми.
Друге изложености могу изазвати синтезу заштитног протеина у телу. Најбољи пример је вероватно металотионеин, који везује кадмијум и подстиче излучивање овог метала; излагање кадмијуму је један од фактора који резултира повећаном експресијом гена за металотионеин. Слични заштитни протеини могу постојати, али још нису довољно истражени да би постали прихваћени као биомаркери. Међу кандидатима за могућу употребу као биомаркери су такозвани протеини стреса, првобитно названи протеини топлотног шока. Ове протеине генерише низ различитих организама као одговор на различита штетна излагања.
Оксидативно оштећење се може проценити одређивањем концентрације малондиалдехида у серуму или издисањем етана. Слично, излучивање протеина са малом молекулском тежином у урину, као што је албумин, може се користити као биомаркер раног оштећења бубрега. Неколико параметара који се рутински користе у клиничкој пракси (на пример, нивои серумских хормона или ензима) такође могу бити корисни као биомаркери. Међутим, многи од ових параметара можда нису довољно осетљиви да би се рано открило оштећење.
Друга група параметара ефеката односи се на генотоксичне ефекте (промене у структури хромозома). Такви ефекти се могу открити микроскопијом белих крвних зрнаца која пролазе кроз ћелијску деобу. Озбиљна оштећења хромозома — хромозомске аберације или формирање микронуклеуса — могу се видети под микроскопом. Оштећење се такође може открити додавањем боје ћелијама током ћелијске деобе. Излагање генотоксичном агенсу се тада може визуализовати као повећана размена боје између две хроматиде сваког хромозома (сестринска размена хроматида). Хромозомске аберације су повезане са повећаним ризиком од развоја канцера, али је значај повећане стопе размене сестринских хроматида мање јасан.
Софистициранија процена генотоксичности заснива се на одређеним тачкастим мутацијама у соматским ћелијама, односно белим крвним зрнцима или епителним ћелијама добијеним из оралне слузокоже. Мутација на одређеном локусу може учинити ћелије способним да расту у култури која садржи хемикалију која је иначе токсична (као што је 6-тиогуанин). Алтернативно, може се проценити специфични генски производ (нпр. концентрације онкопротеина у серуму или ткиву које кодирају одређени онкогени). Очигледно, ове мутације одражавају укупно настало генотоксично оштећење и не указују нужно на било шта о узрочној изложености. Ове методе још нису спремне за практичну употребу у здравству на раду, али брз напредак у овој линији истраживања би сугерисао да ће такве методе постати доступне у року од неколико година.
Биомаркери осетљивости
Маркер осетљивости, било наслеђен или индукован, је индикатор да је појединац посебно осетљив на дејство ксенобиотика или на ефекте групе таквих једињења. Највише пажње је усмерено на генетску подложност, иако други фактори могу бити барем једнако важни. Хиперсензибилност може бити последица наследне особине, конституције појединца или фактора околине.
Способност метаболизма одређених хемикалија је променљива и генетски је одређена (погледајте „Генетске детерминанте токсичног одговора”). Чини се да неколико релевантних ензима контролише један ген. На пример, оксидација страних хемикалија се углавном спроводи у породици ензима који припадају породици П450. Други ензими чине метаболите растворљивијим у води коњугацијом (нпр. Н-ацетилтрансфераза и μ-глутатион-S-трансфераза). Активност ових ензима је генетски контролисана и значајно варира. Као што је горе поменуто, активност се може одредити давањем мале дозе лека, а затим одређивањем количине метаболита у урину. Неки од гена су сада окарактерисани и доступне су технике за одређивање генотипа. Важне студије сугеришу да је ризик од развоја одређених облика рака повезан са способношћу метаболизма страних једињења. Многа питања и даље остају без одговора, чиме се у овом тренутку ограничава употреба ових потенцијалних биомаркера осетљивости у здрављу на раду.
Друге наследне особине, као што је алфа1-недостатак антитрипсина или недостатак глукоза-6-фосфат дехидрогеназе, такође резултира недостатком одбрамбених механизама у телу, што узрокује преосјетљивост на одређене изложености.
Већина истраживања у вези са осетљивошћу бавила се генетском предиспозицијом. Други фактори такође играју улогу и делимично су занемарени. На пример, особе са хроничном болешћу могу бити осетљивије на професионалну изложеност. Такође, ако је процес болести или претходна изложеност токсичним хемикалијама изазвала нека субклиничка оштећења органа, онда ће капацитет да се издржи ново токсично излагање вероватно бити мањи. Биохемијски индикатори функције органа се у овом случају могу користити као биомаркери осетљивости. Можда најбољи пример у вези са хиперсензибилношћу односи се на алергијске реакције. Ако је појединац постао осетљив на одређену изложеност, тада се у серуму могу открити специфична антитела. Чак и ако појединац није постао сензибилизиран, друга тренутна или прошла изложеност може повећати ризик од развоја штетних ефеката повезаних са професионалном изложеношћу.
Велики проблем је утврдити заједнички ефекат мешовитих експозиција на раду. Поред тога, личне навике и употреба дрога могу довести до повећане осетљивости. На пример, дувански дим обично садржи значајну количину кадмијума. Дакле, уз професионалну изложеност кадмијуму, тешки пушач који је акумулирао значајне количине овог метала у телу биће изложен повећаном ризику од развоја болести бубрега повезаних са кадмијумом.
Примена у здравству на раду
Биомаркери су изузетно корисни у токсиколошким истраживањима, а многи могу бити применљиви у биолошком праћењу. Без обзира на то, ограничења се такође морају препознати. Многи биомаркери су до сада проучавани само на лабораторијским животињама. Токсикокинетички обрасци код других врста не морају нужно да одражавају ситуацију код људи, а екстраполација може захтевати потврдне студије на људским добровољцима. Такође, морају се узети у обзир индивидуалне варијације због генетских или уставних фактора.
У неким случајевима, биомаркери изложености можда уопште нису изводљиви (нпр. за хемикалије које су краткотрајне ин виво). Друге хемикалије се могу складиштити или могу утицати на органе којима се не може приступити рутинским процедурама, као што је нервни систем. Пут излагања такође може утицати на образац дистрибуције, а самим тим и на мерење биомаркера и његову интерпретацију. На пример, директно излагање мозга преко олфакторног нерва ће вероватно избећи детекцију мерењем биомаркера изложености. Што се тиче ефеката биомаркера, многи од њих нису уопште специфични, а промена може бити узрокована разним узроцима, укључујући факторе начина живота. Можда посебно у вези са биомаркерима осетљивости, тумачење у овом тренутку мора бити веома опрезно, пошто остаје много неизвесности у вези са укупним здравственим значајем појединачних генотипова.
У здравству на раду, идеални биомаркер треба да задовољи неколико захтева. Пре свега, прикупљање и анализа узорака морају бити једноставни и поуздани. За оптималан аналитички квалитет потребна је стандардизација, али специфични захтеви значајно варирају. Главне области које изазивају забринутост укључују: припрему појединца, поступак узорковања и руковање узорком и поступак мерења; ово последње обухвата техничке факторе, као што су процедуре калибрације и осигурања квалитета, и факторе везане за појединца, као што су образовање и обука оператера.
За документацију аналитичке валидности и следљивости, референтни материјали треба да се заснивају на релевантним матрицама и са одговарајућим концентрацијама токсичних супстанци или релевантних метаболита на одговарајућим нивоима. Да би се биомаркери користили за биолошки мониторинг или у дијагностичке сврхе, одговорне лабораторије морају имати добро документоване аналитичке процедуре са дефинисаним карактеристикама перформанси и доступне записе који омогућавају верификацију резултата. У исто време, без обзира на то, економичност карактеризације и коришћења референтних материјала као допуна процедура обезбеђења квалитета уопште мора бити узета у обзир. Стога, достижни квалитет резултата и употреба на коју се они користе, морају бити у равнотежи са додатним трошковима осигурања квалитета, укључујући референтне материјале, радну снагу и инструментацију.
Други захтев је да биомаркер треба да буде специфичан, барем под околностима студије, за одређену врсту изложености, са јасним односом према степену изложености. У супротном, резултат мерења биомаркера може бити превише тежак за тумачење. За правилно тумачење резултата мерења биомаркера изложености, мора бити позната дијагностичка валидност (тј. превод вредности биомаркера у величину могућих здравствених ризика). У овој области, метали служе као парадигма за истраживање биомаркера. Недавна истраживања су показала сложеност и суптилност односа доза-одговор, са значајним потешкоћама у идентификацији нивоа без ефекта, а самим тим и у дефинисању подношљивих излагања. Међутим, ова врста истраживања је такође илустровала врсте истраживања и префињености које су неопходне да би се откриле релевантне информације. За већину органских једињења, квантитативне везе између изложености и одговарајућих штетних ефеката на здравље још нису доступне; у многим случајевима чак ни примарни циљни органи нису поуздани. Поред тога, процена података о токсичности и концентрација биомаркера је често компликована излагањем смешама супстанци, пре него излагањем једном једињењу у то време.
Пре него што се биомаркер примени у сврхе здравља на раду, неопходна су нека додатна разматрања. Прво, биомаркер мора одражавати само субклиничку и реверзибилну промену. Друго, с обзиром на то да се резултати биомаркера могу тумачити у односу на ризике по здравље, онда превентивни напори треба да буду доступни и треба их сматрати реалистичним у случају да подаци о биомаркерима указују на потребу да се смањи изложеност. Треће, практична употреба биомаркера се генерално мора сматрати етички прихватљивом.
Мерења индустријске хигијене могу се упоредити са применљивим границама изложености. Слично томе, резултати о биомаркерима изложености или биомаркерима ефеката могу се упоредити са границама биолошког деловања, који се понекад називају индекси биолошке изложености. Таква ограничења би требало да буду заснована на најбољим саветима клиничара и научника из одговарајућих дисциплина, а одговорни администратори као „менаџери ризика“ треба да узму у обзир релевантне етичке, друштвене, културне и економске факторе. Научна основа би, ако је могуће, требало да укључи односе доза-одговор допуњене информацијама о варијацијама у осетљивости унутар ризичне популације. У неким земљама, радници и припадници опште јавности укључени су у процес постављања стандарда и дају важан допринос, посебно када је научна несигурност знатна. Једна од главних нејасноћа је како дефинисати нежељени ефекат на здравље који треба спречити—на пример, да ли формирање адукта као биомаркера изложености само по себи представља нежељени ефекат (тј. биомаркер ефекта) који треба спречити. Вероватно ће се појавити тешка питања када се одлучује да ли је етички одбрамбено да за исто једињење има различите границе за случајну изложеност, с једне стране, и професионалну изложеност, с друге.
Информације добијене употребом биомаркера генерално треба да се пренесу појединцима који се прегледају у оквиру односа лекар-пацијент. Етички проблеми се морају посебно размотрити у вези са високо експерименталним анализама биомаркера које се тренутно не могу детаљно тумачити у смислу стварних здравствених ризика. За општу популацију, на пример, тренутно постоје ограничене смернице у погледу тумачења биомаркера изложености осим концентрације олова у крви. Такође је важно поверење у добијене податке (тј. да ли је урађено одговарајуће узорковање и да ли су у укљученој лабораторији коришћене добре процедуре за обезбеђење квалитета). Додатна област посебне бриге односи се на индивидуалну преосјетљивост. Ова питања се морају узети у обзир приликом пружања повратних информација из студије.
Сви сектори друштва на које утиче студија о биомаркерима или се баве извођењем студије о биомаркерима морају бити укључени у процес доношења одлука о томе како поступати са информацијама добијеним од студије. Специфичне процедуре за спречавање или превазилажење неизбежних етичких сукоба треба да буду развијене у правним и друштвеним оквирима региона или земље. Међутим, свака ситуација представља другачији скуп питања и замки, и не може се развити јединствена процедура за укључивање јавности која би обухватила све примене биомаркера изложености.
Процена генетске токсичности
Процена генетичке токсичности је процена агенса за њихову способност да изазову било коју од три општа типа промена (мутација) у генетском материјалу (ДНК): генске, хромозомске и геномске. У организмима као што су људи, гени се састоје од ДНК, која се састоји од појединачних јединица које се зову нуклеотидне базе. Гени су распоређени у дискретне физичке структуре које се називају хромозоми. Генотоксичност може довести до значајних и неповратних ефеката на људско здравље. Генотоксично оштећење је критичан корак у индукцији рака и такође може бити укључено у индукцију урођених мана и феталне смрти. Три класе мутација које су горе поменуте могу се јавити унутар било којег од два типа ткива које поседују организми као што су људи: сперматозоида или јајашца (герминативне ћелије) и преосталог ткива (соматске ћелије).
Тестови који мере мутацију гена су они који откривају супституцију, додавање или брисање нуклеотида унутар гена. Тестови који мере хромозомску мутацију су они који откривају ломове или хромозомске преуређење које укључује један или више хромозома. Тестови који мере геномску мутацију су они који откривају промене у броју хромозома, стање које се зове анеуплоидија. Процена генетске токсичности се значајно променила од када је Херман Мулер 1927. године развио први тест за откривање генотоксичних (мутагених) агенаса. Од тада је развијено више од 200 тестова који мере мутације у ДНК; међутим, данас се обично користи мање од десет тестова за процену генетске токсичности. Овај чланак даје преглед ових тестова, описује шта они мере и истражује улогу ових тестова у процени токсичности.
Идентификација опасности од рака Пре развоја Поље генетске токсикологије
Генетска токсикологија је постала саставни део целокупног процеса процене ризика и стекла је у последње време као поуздани предиктор канцерогене активности. Међутим, пре развоја генетске токсикологије (пре 1970), друге методе су се користиле и још увек се користе за идентификацију потенцијалних опасности од рака за људе. Постоји шест главних категорија метода које се тренутно користе за идентификацију ризика од рака код људи: епидемиолошке студије, дугорочни ин виво биолошки тестови, средњорочни ин виво биолошки тестови, краткорочни ин виво и ин витро биолошки тестови, вештачка интелигенција (структура-активност), и закључивање засновано на механизму.
Табела 1 даје предности и недостатке ових метода.
Табела 1. Предности и недостаци актуелних метода за идентификацију ризика од рака код људи
| Предности | Мане | |
| Епидемиолошке студије | (1) људи су крајњи показатељи болести; (2) процени осетљиве или осетљиве популације; (3) кохорте професионалне изложености; (4) упозорења за чување животне средине |
(1) генерално ретроспективно (извод из матичне књиге умрлих, пристрасност опозива, итд.); (2) неосетљив, скуп, дуготрајан; (3) поуздани подаци о изложености понекад недоступни или их је тешко добити; (4) комбиноване, вишеструке и сложене изложености; недостатак одговарајућих контролних кохорти; (5) експерименти на људима нису урађени; (6) откривање рака, а не превенција |
| Дугорочни ин виво биолошки тестови | (1) проспективне и ретроспективне (валидационе) евалуације; (2) одлична корелација са идентификованим људским канцерогенима; (3) познати нивои изложености и услови; (4) идентификује хемијску токсичност и ефекте канцерогености; (5) резултати добијени релативно брзо; (6) квалитативна поређења између хемијских класа; (7) интегративни и интерактивни биолошки системи који су блиско повезани са људима | (1) ретко реплициран, интензиван ресурсима; (3) ограничене просторије погодне за такве експерименте; (4) расправа о екстраполацији врста; (5) коришћене експозиције су често на нивоима који су далеко већи од оних које доживљавају људи; (6) излагање једном хемикалијама не опонаша излагање људи, које се углавном односи на више хемикалија истовремено |
| Средњо- и краткорочни ин виво и ин витро биолошки тестови | (1) бржи и јефтинији од других тестова; (2) велики узорци који се лако реплицирају; (3) мере се биолошки значајне крајње тачке (мутација, итд.); (4) могу се користити као скрининг тестови за одабир хемикалија за дуготрајне биотестове |
(1) ин витро не предвиђа у потпуности ин виво; (2) обично специфично за организам или орган; (3) потенције које се не могу поредити са целим животињама или људима |
| Хемијска структура–биолошка активност | (1) релативно лако, брзо и јефтино; (2) поуздан за одређене хемијске класе (нпр. нитрозамини и бензидинске боје); (3) развијен на основу биолошких података, али не зависи од додатних биолошких експеримената | (1) не „биолошки”; (2) многи изузеци од формулисаних правила; (3) ретроспективан и ретко (али постаје) проспективан |
| Закључци засновани на механизму | (1) разумно тачне за одређене класе хемикалија; (2) дозвољава прецизирање хипотеза; (3) може да оријентише процене ризика на осетљиве популације | (1) механизми хемијске карциногенезе недефинисани, вишеструки и вероватно специфични за хемикалије или класу; (2) може пропустити да истакне изузетке од општих механизама |
Образложење и концептуална основа за генетске токсиколошке анализе
Иако се тачни типови и број тестова који се користе за процену генетске токсичности стално развијају и варирају од земље до земље, најчешћи су тестови за (1) генске мутације у бактеријама и/или култивисаним ћелијама сисара и (2) хромозомске мутације у култивисане ћелије сисара и/или коштану срж унутар живих мишева. Неки од тестова у оквиру ове друге категорије такође могу открити анеуплоидију. Иако ови тестови не откривају мутације у заметним ћелијама, они се првенствено користе због додатних трошкова и сложености извођења тестова заметних ћелија. Без обзира на то, тестови заметних ћелија код мишева се користе када су пожељне информације о ефектима заметних ћелија.
Систематске студије током периода од 25 година (1970-1995), посебно у америчком Националном токсиколошком програму у Северној Каролини, резултирале су употребом дискретног броја тестова за откривање мутагене активности агенаса. Образложење за процену корисности тестова заснивало се на њиховој способности да открију агенсе који изазивају рак код глодара и за које се сумња да изазивају рак код људи (тј. канцерогене). То је зато што су студије током последњих неколико деценија показале да ћелије рака садрже мутације у одређеним генима и да су многи карциногени такође мутагени. Према томе, ћелије рака се посматрају као оне које садрже мутације соматских ћелија, а карциногенеза се посматра као врста мутагенезе соматских ћелија.
Тестови генетске токсичности који се данас најчешће користе одабрани су не само због њихове велике базе података, релативно ниске цене и лакоће извођења, већ и због тога што се показало да откривају многе карциногене за глодаре и, претпоставља се, за људе. Сходно томе, тестови генетске токсичности се користе за предвиђање потенцијалне канцерогености агенаса.
Важан концептуални и практични развој у области генетске токсикологије било је признање да су многи карциногени модификовани ензимима унутар тела, стварајући измењене облике (метаболите) који су често били крајњи канцероген и мутагени облик матичне хемикалије. Да би поновио овај метаболизам у петријевој посуди, Хајнрих Малинг је показао да укључивање препарата из јетре глодара садржи многе ензиме неопходне за обављање ове метаболичке конверзије или активације. Стога, многи тестови генетске токсичности изведени у посудама или епруветама (ин витро) користе додавање сличних ензимских препарата. Једноставни препарати се називају С9 микс, а пречишћени микрозоми. Неке ћелије бактерија и сисара су сада генетски модификоване да садрже неке од гена глодара или људи који производе ове ензиме, смањујући потребу за додавањем С9 мешавине или микрозома.
Генетски токсиколошки тестови и технике
Примарни бактеријски системи који се користе за скрининг генетске токсичности су тест мутагености салмонеле (Амес) и, у много мањој мери, сој ВП2 од Есцхерицхиа цоли. Студије средином 1980-их су показале да је употреба само два соја Салмонелла система (ТА98 и ТА100) била довољна за откривање приближно 90% познатих мутагена салмонеле. Дакле, ова два соја се користе за већину скрининг сврха; међутим, разни други сојеви су доступни за опсежније тестирање.
Ови тестови се изводе на различите начине, али две опште процедуре су тестови уградње плоче и тестови суспензије течности. У тесту инкорпорације плоче, ћелије, испитивана хемикалија и (по жељи) С9 се додају заједно у течни агар и сипају на површину агар петријеве плоче. Горњи агар се стврдне у року од неколико минута, а плоче се инкубирају два до три дана, након чега су мутантне ћелије нарасле да формирају визуелно уочљиве групе ћелија које се називају колоније, које се затим броје. Агар медијум садржи селективне агенсе или је састављен од састојака тако да ће расти само новомутиране ћелије. Тест инкубације у течности је сличан, осим што се ћелије, тест агенс и С9 инкубирају заједно у течности која не садржи течни агар, а затим се ћелије исперу од тест агенса и С9 и засеју на агар.
Мутације у култивисаним ћелијама сисара се откривају првенствено у једном од два гена: хпрт tk. Слично као код бактеријских тестова, ћелијске линије сисара (развијене од ћелија глодара или људи) се излажу испитиваном агенсу у пластичним посудама за културу или епруветама, а затим се засеју у посуде за културу које садрже медијум са селективним агенсом који дозвољава само мутантним ћелијама да расту . Тестови који се користе у ову сврху укључују ЦХО/ХПРТ, ТК6 и мишји лимфом Л5178И/ТК+ / - есеји. Користе се и друге ћелијске линије које садрже различите мутације за поправку ДНК, као и неке људске гене укључене у метаболизам. Ови системи дозвољавају опоравак мутација унутар гена (мутација гена), као и мутација које укључују регионе хромозома који прате ген (хромозомска мутација). Међутим, овај други тип мутације се обнавља у много већој мери tk генских система него по хпрт генских система због локације на tk ген.
Слично тесту инкубације у течности за бактеријску мутагеност, тестови мутагености ћелија сисара углавном укључују излагање ћелија у посудама за културу или епруветама у присуству тест агенса и С9 током неколико сати. Ћелије се затим исперу, култивишу још неколико дана да би се омогућило да се нормални (дивљи тип) генских производа разгради и да се нови мутантни генски производи експресују и акумулирају, а затим се засеју у медијум који садржи селективни агенс који дозвољава да расту само мутантне ћелије. Као и код бактеријских тестова, мутантне ћелије расту у визуелно уочљиве колоније које се затим броје.
Хромозомска мутација се идентификује првенствено цитогенетским тестовима, који укључују излагање глодара и/или ћелија глодара или људи у посудама за културу испитиваној хемикалији, омогућавајући једну или више деоба ћелија, бојење хромозома, а затим визуелно испитивање хромозома под микроскопом за откривање промена у структури или броју хромозома. Иако се могу испитати различите крајње тачке, две које регулаторне агенције тренутно прихватају као најзначајније су хромозомске аберације и поткатегорија која се зове микронуклеуси.
Потребна је значајна обука и стручност да би се ћелије процениле на присуство хромозомских аберација, што ову процедуру чини скупом у смислу времена и новца. Насупрот томе, микронуклеуси захтевају мало обуке, а њихово откривање може бити аутоматизовано. Микронуклеуси се појављују као мале тачке унутар ћелије које се разликују од језгра, које садржи хромозоме. Микронуклеуси су резултат или ломљења хромозома или анеуплоидије. Због лакоће оцењивања микронуклеуса у поређењу са хромозомским аберацијама и због тога што недавне студије показују да агенси који изазивају хромозомске аберације у коштаној сржи живих мишева генерално индукују микронуклеусе у овом ткиву, микронуклеуси се данас обично мере као показатељ способности агенс који изазива хромозомске мутације.
Иако се тестови заметних ћелија користе много ређе него други горе описани тестови, они су неопходни у одређивању да ли агенс представља ризик за заметне ћелије, мутације у којима могу довести до здравствених ефеката у наредним генерацијама. Најчешће коришћени тестови заметних ћелија су код мишева и укључују системе који откривају (1) наследне транслокације (размену) међу хромозомима (тест наследне транслокације), (2) генске или хромозомске мутације које укључују специфичне гене (видљиви или биохемијски специфични локус тестови) и (3) мутације које утичу на одрживост (доминантни тест смрти). Као и код тестова соматских ћелија, радна претпоставка код тестова заметних ћелија је да се претпоставља да су агенси позитивни у овим тестовима потенцијални мутагени људских заметних ћелија.
Тренутни статус и будући изгледи
Недавне студије су показале да су само три информације биле неопходне да би се открило приближно 90% скупа од 41 канцерогена за глодаре (тј. претпостављених карциногена за људе и мутагена соматских ћелија). Ово укључује (1) познавање хемијске структуре агенса, посебно ако садржи електрофилне делове (видети одељак о односима структуре и активности); (2) подаци о мутагености салмонеле; и (3) податке из 90-дневног теста хроничне токсичности код глодара (мишева и пацова). Заиста, сви хумани карциногени које је прогласио ИАРЦ могу се открити као мутагени користећи само тест салмонеле и микронуклеусни тест мишје коштане сржи. Употреба ових тестова мутагености за откривање потенцијалних канцерогена за људе је додатно подржана налазом да је већина канцерогена за људе канцерогена и код пацова и код мишева (канцерогени за транс-врсте) и да је већина канцерогена за транс-врсте мутагена у салмонели и/или индукују микронуклеусе. у коштаној сржи миша.
Са напретком у ДНК технологији, пројекту људског генома и побољшаним разумевањем улоге мутације у раку, развијају се нови тестови генотоксичности који ће вероватно бити укључени у стандардне процедуре скрининга. Међу њима је употреба трансгених ћелија и глодара. Трансгени системи су они у којима је ген друге врсте унет у ћелију или организам. На пример, трансгени мишеви су сада у експерименталној употреби која омогућава откривање мутације у било ком органу или ткиву животиње, на основу увођења бактеријског гена у миша. Сада су доступне бактеријске ћелије, као што је салмонела, и ћелије сисара (укључујући људске ћелијске линије) које садрже гене укључене у метаболизам канцерогених/мутагених агенаса, као што су гени П450. Молекуларна анализа стварних мутација индукованих у транс-гену код трансгених глодара, или унутар нативних гена као нпр. хпрт, или циљни гени унутар салмонеле сада се могу извести, тако да се може утврдити тачна природа мутација изазваних хемикалијама, пружајући увид у механизам деловања хемикалије и омогућавајући поређења са мутацијама код људи који су вероватно били изложени агенсу .
Молекуларни напредак у цитогенетици сада омогућава детаљнију процену хромозомских мутација. То укључује употребу сонди (малих делова ДНК) које се везују (хибридизују) за специфичне гене. Преуређивање гена на хромозому се тада може открити измењеном локацијом сонди, које су флуоресцентне и лако се визуализују као обојени сектори на хромозомима. Једноћелијски гел електрофорезни тест за ломљење ДНК (који се обично назива „кометски” тест) дозвољава откривање прекида ДНК унутар појединачних ћелија и може постати изузетно користан алат у комбинацији са цитогенетским техникама за откривање хромозомских оштећења.
После много година употребе и стварања велике и систематски развијене базе података, процена генетске токсичности сада се може урадити са само неколико тестова за релативно мале трошкове у кратком временском периоду (неколико недеља). Добијени подаци се могу користити за предвиђање способности неког агенса да буде глодар и, претпоставља се, хумани канцероген/мутаген соматских ћелија. Таква способност омогућава да се ограничи уношење мутагених и канцерогених агенаса у животну средину и да се развију алтернативни, немутагени агенси. Будуће студије би требало да доведу до још бољих метода са већом предиктивношћу од тренутних тестова.
Ин витро испитивање токсичности
Појава софистицираних технологија у молекуларној и ћелијској биологији подстакла је релативно брзу еволуцију у наукама о животу, укључујући токсикологију. У ствари, фокус токсикологије се помера са целих животиња и популације целих животиња на ћелије и молекуле појединачних животиња и људи. Од средине 1980-их, токсиколози су почели да користе ове нове методологије у процени ефеката хемикалија на живе системе. Као логичан напредак, такве методе се прилагођавају за потребе испитивања токсичности. Ова научна достигнућа су радила заједно са друштвеним и економским факторима како би утицала на промену у процени безбедности производа и потенцијалног ризика.
Економски фактори су посебно повезани са запремином материјала који се мора тестирати. Сваке године на тржиште се уводи мноштво нових козметичких, фармацеутских, пестицида, хемикалија и производа за домаћинство. Сви ови производи морају бити процењени на њихову потенцијалну токсичност. Поред тога, постоји заостатак хемикалија које су већ у употреби које нису адекватно тестиране. Огроман задатак добијања детаљних безбедносних информација о свим овим хемикалијама коришћењем традиционалних метода испитивања целих животиња био би скуп и у смислу новца и времена, ако би уопште могао да се оствари.
Постоје и друштвена питања која се односе на јавно здравље и безбедност, као и све већа забринутост јавности у вези са употребом животиња за тестирање безбедности производа. Што се тиче безбедности људи, групе за јавни интерес и заштиту животне средине извршиле су значајан притисак на владине агенције да примењују строже прописе о хемикалијама. Недавни пример овога је покрет неких еколошких група за забрану хлора и једињења која садрже хлор у Сједињеним Државама. Једна од мотивација за тако екстремну акцију лежи у чињеници да већина ових једињења никада није била адекватно испитана. Из токсиколошке перспективе, концепт забране читаве класе различитих хемикалија заснованих само на присуству хлора је и научно неисправан и неодговоран. Ипак, разумљиво је да из перспективе јавности мора постојати извесна гаранција да хемикалије које се испуштају у животну средину не представљају значајан ризик по здравље. Таква ситуација наглашава потребу за ефикаснијим и бржим методама за процену токсичности.
Друга друштвена брига која је утицала на област испитивања токсичности је добробит животиња. Све већи број група за заштиту животиња широм света изразио је значајно противљење употреби целих животиња за тестирање безбедности производа. Активне кампање вођене су против произвођача козметике, производа за домаћинство и личну негу и фармацеутских производа у покушају да се зауставе тестирање на животињама. Такви напори у Европи су резултирали усвајањем Шестог амандмана на Директиву 76/768/ЕЕЦ (Директива о козметици). Последица ове Директиве је да се козметички производи или козметички састојци који су тестирани на животињама после 1. јануара 1998. године не могу пласирати на тржиште Европске уније, осим ако алтернативне методе нису довољно валидиране. Иако ова Директива нема надлежност над продајом таквих производа у Сједињеним Државама или другим земљама, она ће значајно утицати на компаније које имају међународна тржишта која укључују Европу.
Концепт алтернатива, који чини основу за развој тестова, осим оних на целим животињама, дефинисан је са три Rs: Смањење у броју коришћених животиња; пречишћавање протокола тако да животиње доживљавају мање стреса или нелагодности; и замена актуелних тестова на животињама са ин витро тестовима (тј. тестовима који се раде ван живих животиња), компјутерским моделима или тестовима на нижим врстама кичмењака или бескичмењака. Три Rсу представљени у књизи коју су 1959. објавила два британска научника, ВМС Русселл и Рек Бурцх, Принципи хумане експерименталне технике. Расел и Бурч су сматрали да је једини начин на који се могу добити валидни научни резултати кроз хуман третман према животињама и веровали су да треба развити методе како би се смањила употреба животиња и на крају је заменила. Занимљиво је да су принципи које су изнели Расел и Бурч добили мало пажње све до поновног оживљавања покрета за добробит животиња средином 1970-их. Данас концепт троје Rс је веома у првом плану у погледу истраживања, тестирања и образовања.
Укратко, на развој методологија ин витро тестирања утицали су различити фактори који су се приближили током последњих десет до 20 година. Тешко је утврдити да ли би било који од ових фактора сам по себи имао тако дубок утицај на стратегије испитивања токсичности.
Концепт ин витро тестова токсичности
Овај одељак ће се фокусирати искључиво на ин витро методе за процену токсичности, као једну од алтернатива тестирању на целим животињама. Додатне не-животињске алтернативе, као што су компјутерско моделирање и квантитативни односи структуре и активности, разматрају се у другим чланцима овог поглавља.
Ин витро студије се генерално спроводе на животињским или људским ћелијама или ткивима ван тела. Ин витро буквално значи „у стаклу“ и односи се на поступке који се спроводе на живом материјалу или компонентама живог материјала узгајаног у петријевим посудама или у епруветама под дефинисаним условима. Ово се може супротставити студијама ин виво или онима које су спроведене „на живим животињама“. Иако је тешко, ако не и немогуће, пројектовати ефекте хемикалије на сложени организам када су посматрања ограничена на једну врсту ћелија у посуди, ин витро студије такође пружају значајну количину информација о интринзичној токсичности. као ћелијски и молекуларни механизми токсичности. Поред тога, оне нуде многе предности у односу на ин виво студије у томе што су генерално јефтиније и могу се спроводити под више контролисаним условима. Штавише, упркос чињеници да је још увек потребан мали број животиња за добијање ћелија за ин витро културе, ове методе се могу сматрати алтернативама редукције (пошто се користи много мање животиња у поређењу са ин виво студијама) и алтернативама за пречишћавање (јер елиминишу потребу подвргавање животиња штетним токсичним последицама које намећу експерименти ин виво).
Да би се интерпретирали резултати испитивања токсичности ин витро, утврдила њихова потенцијална корисност у процени токсичности и повезали их са укупним токсиколошким процесом ин виво, неопходно је разумети који део токсиколошког процеса се испитује. Цео токсиколошки процес састоји се од догађаја који почињу излагањем организма физичком или хемијском агенсу, напредују кроз ћелијске и молекуларне интеракције и на крају се манифестују у одговору целог организма. Ин витро тестови су генерално ограничени на део токсиколошког процеса који се одвија на ћелијском и молекуларном нивоу. Типови информација које се могу добити из ин витро студија укључују путеве метаболизма, интеракцију активних метаболита са ћелијским и молекуларним циљевима и потенцијално мерљиве токсичне крајње тачке које могу послужити као молекуларни биомаркери за излагање. У идеалној ситуацији, механизам токсичности сваке хемикалије од излагања до манифестације организма био би познат, тако да би се информације добијене ин витро тестовима могле у потпуности тумачити и повезати са одговором целог организма. Међутим, то је практично немогуће, пошто је релативно мало комплетних токсиколошких механизама разјашњено. Дакле, токсиколози су суочени са ситуацијом у којој се резултати ин витро теста не могу користити као потпуно тачно предвиђање ин виво токсичности јер је механизам непознат. Међутим, често се током процеса развоја ин витро теста разјашњавају компоненте ћелијског и молекуларног механизма(а) токсичности.
Једно од кључних нерешених питања у вези са развојем и имплементацијом ин витро тестова односи се на следеће разматрање: да ли они морају бити механички засновани или је довољно да буду дескриптивни? Из научне перспективе несумњиво је боље користити само механичке тестове као замену за ин виво тестове. Међутим, у недостатку потпуног механистичког знања, изгледи за развој ин витро тестова који би у потпуности заменили тестове на животињама у блиској будућности су скоро никакви. Ово, међутим, не искључује употребу дескриптивнијих типова тестова као раних алата за скрининг, што је тренутно случај. Ови екрани су довели до значајног смањења употребе животиња. Стога, све док се не генерише више механичких информација, можда ће бити неопходно применити у ограниченој мери тестове чији резултати једноставно добро корелирају са онима добијеним ин виво.
Ин витро тестови за цитотоксичност
У овом одељку биће описано неколико ин витро тестова који су развијени за процену цитотоксичног потенцијала хемикалије. Углавном, ови тестови су лаки за извођење и анализа се може аутоматизовати. Један који се обично користи ин витро тест за цитотоксичност је неутрални црвени тест. Овај тест се ради на ћелијама у култури, а за већину примена, ћелије се могу одржавати у посудама за културу које садрже 96 малих бунара, сваки пречника 6.4 мм. Пошто сваки бунар може да се користи за једно одређивање, овај распоред може да прихвати више концентрација испитиване хемикалије, као и позитивне и негативне контроле са довољним бројем понављања за сваку. Након третмана ћелија различитим концентрацијама испитиване хемикалије у распону од најмање два реда величине (нпр. од 0.01 мМ до 1 мМ), као и хемикалијама позитивне и негативне контроле, ћелије се испиру и третирају неутралном црвеном бојом, а боја коју могу да усвоје и задрже само живе ћелије. Боја се може додати након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили непосредни ефекти, или се може додати у различито време након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили кумулативни или одложени ефекти. Интензитет боје у сваком бунарчићу одговара броју живих ћелија у том бунарчићу. Интензитет боје се мери спектрофотометром који може бити опремљен читачем плоча. Читач плоча је програмиран да обезбеди појединачна мерења за сваки од 96 бунарчића посуде за културу. Ова аутоматизована методологија дозвољава истраживачу да брзо изведе експеримент концентрације и одговора и да добије статистички корисне податке.
Још један релативно једноставан тест за цитотоксичност је МТТ тест. МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолијум бромид) је тетразолијумова боја коју митохондријски ензими редукују у плаву боју. Само ћелије са одрживим митохондријама ће задржати способност да спроведу ову реакцију; стога је интензитет боје директно повезан са степеном интегритета митохондрија. Ово је користан тест за откривање општих цитотоксичних једињења, као и оних агенаса који специфично циљају митохондрије.
Мерење активности лактат дехидрогеназе (ЛДХ) се такође користи као тест широког спектра цитотоксичности. Овај ензим је нормално присутан у цитоплазми живих ћелија и ослобађа се у медијум ћелијске културе кроз ћелијске мембране мртвих или умирућих ћелија које су биле штетно погођене токсичним агенсом. Мале количине медијума за културу могу се уклонити у различитим временима након хемијског третмана ћелија да би се измерила количина ослобођеног ЛДХ и одредио временски ток токсичности. Иако је тест ослобађања ЛДХ веома општа процена цитотоксичности, он је користан јер се лако изводи и може се урадити у реалном времену.
Постоји много нових метода које се развијају за откривање оштећења ћелија. Софистицираније методе користе флуоресцентне сонде за мерење различитих интрацелуларних параметара, као што су ослобађање калцијума и промене пХ и мембранског потенцијала. Генерално, ове сонде су веома осетљиве и могу открити суптилније ћелијске промене, чиме се смањује потреба за коришћењем ћелијске смрти као крајње тачке. Поред тога, многи од ових флуоресцентних тестова могу бити аутоматизовани коришћењем плоча са 96 јажица и читача флуоресцентних плоча.
Када се прикупе подаци о низу хемикалија помоћу једног од ових тестова, може се одредити релативна токсичност. Релативна токсичност хемикалије, утврђена ин витро тестом, може се изразити као концентрација која има 50% ефекта на одговор крајње тачке нетретираних ћелија. Ова одлука се назива ЕК50 (Eефективно Cконцентрација за 50% ћелија) и може се користити за поређење токсичности различитих хемикалија ин витро. (Сличан термин који се користи у процени релативне токсичности је ИЦ50, што указује на концентрацију хемикалије која изазива 50% инхибицију ћелијског процеса, нпр. способност да преузме неутрално црвено.) Није лако проценити да ли је релативна ин витро токсичност хемикалија упоредива са њиховом релативном у виво токсичности, пошто постоји толико збуњујућих фактора у систему ин виво, као што су токсикокинетика, метаболизам, поправка и одбрамбени механизми. Поред тога, пошто већина ових тестова мери опште крајње тачке цитотоксичности, они нису механички засновани. Стога је слагање између ин витро и ин виво релативне токсичности једноставно корелативно. Упркос бројним сложеностима и потешкоћама у екстраполацији са ин витро на ин виво, ови ин витро тестови су се показали веома вредним јер су једноставни и јефтини за извођење и могу се користити као екрани за означавање високо токсичних лекова или хемикалија у раним фазама развој.
Токсичност циљног органа
Ин витро тестови се такође могу користити за процену специфичне токсичности циљног органа. Постоје бројне потешкоће повезане са дизајнирањем таквих тестова, од којих је најзначајнија неспособност ин витро система да одрже многе карактеристике органа ин виво. Често, када се ћелије узму од животиња и ставе у културу, оне имају тенденцију или да брзо дегенеришу и/или да се дедиференцирају, односно изгубе своје функције сличне органу и постану генеричке. Ово представља проблем јер у кратком временском периоду, обично неколико дана, културе више нису корисне за процену ефеката токсина специфичних за органе.
Многи од ових проблема се превазилазе због недавног напретка у молекуларној и ћелијској биологији. Информације које се добију о ћелијском окружењу ин виво могу се користити за модулацију услова културе ин витро. Од средине 1980-их, откривени су нови фактори раста и цитокини, а многи од њих су сада доступни комерцијално. Додавање ових фактора ћелијама у култури помаже у очувању њиховог интегритета и такође може помоћи да се задрже више диференциране функције током дужег временског периода. Друге основне студије су повећале знање о нутритивним и хормонским потребама ћелија у култури, тако да се могу формулисати нови медији. Недавни напредак је такође постигнут у идентификацији природних и вештачких екстрацелуларних матрица на којима се ћелије могу узгајати. Култура ћелија на овим различитим матрицама може имати дубоке ефекте и на њихову структуру и на функцију. Главна предност која произилази из овог знања је способност да се замршено контролише окружење ћелија у култури и појединачно испитају ефекти ових фактора на основне ћелијске процесе и на њихове одговоре на различите хемијске агенсе. Укратко, ови системи могу пружити сјајан увид у механизме токсичности специфичне за органе.
Многе студије токсичности за циљне органе спроводе се у примарним ћелијама, које су по дефиницији свеже изоловане из органа и обично показују ограничен животни век у култури. Постоје многе предности поседовања примарних култура једног типа ћелије из органа за процену токсичности. Из механичке перспективе, такве културе су корисне за проучавање специфичних ћелијских циљева хемикалије. У неким случајевима, два или више типова ћелија из органа могу се култивисати заједно, а ово пружа додатну предност у могућности да се посматрају интеракције ћелија-ћелија као одговор на токсин. Неки системи ко-културе за кожу су конструисани тако да формирају тродимензионалну структуру која личи на кожу ин виво. Такође је могуће заједно култивисати ћелије из различитих органа — на пример, јетре и бубрега. Ова врста културе би била корисна у процени ефеката специфичних за ћелије бубрега, хемикалије која се мора биоактивирати у јетри.
Молекуларно биолошки алати су такође играли важну улогу у развоју континуираних ћелијских линија које могу бити корисне за испитивање токсичности циљних органа. Ове ћелијске линије се генеришу трансфекцијом ДНК у примарне ћелије. У поступку трансфекције, ћелије и ДНК се третирају тако да ДНК могу да преузму ћелије. ДНК је обично од вируса и садржи ген или гене који, када се експримирају, омогућавају ћелијама да постану овековечене (тј. способне да живе и расту у дужем временском периоду у култури). ДНК се такође може конструисати тако да бесмртни ген контролише индуцибилни промотер. Предност ове врсте конструкта је у томе што ће се ћелије поделити само када добију одговарајући хемијски стимуланс који омогућава експресију бесмртног гена. Пример таквог конструкта је велики ген Т антигена из Симиан вируса 40 (СВ40) (ген за бесмртност), коме претходи промоторски регион металотионеинског гена, који је индукован присуством метала у медијуму културе. Дакле, након што је ген трансфектован у ћелије, ћелије се могу третирати ниским концентрацијама цинка да би се стимулисао МТ промотор и укључила експресија гена Т антигена. У овим условима, ћелије се размножавају. Када се цинк уклони из медијума, ћелије престају да се деле и под идеалним условима се враћају у стање у коме изражавају своје функције специфичне за ткиво.
Способност стварања бесмртних ћелија у комбинацији са напретком у технологији ћелијске културе у великој мери је допринела стварању ћелијских линија из многих различитих органа, укључујући мозак, бубреге и јетру. Међутим, пре него што се ове ћелијске линије могу користити као сурогат за веродостојне типове ћелија, морају се пажљиво окарактерисати да би се утврдило колико су „нормалне“ заиста.
Други ин витро системи за проучавање токсичности циљних органа укључују све већу сложеност. Како ин витро системи напредују у сложености од једне ћелије до културе целог органа, они постају све упоредивији са ин виво миљеом, али у исто време постају много тежи за контролу с обзиром на повећан број варијабли. Стога, оно што се може добити преласком на виши ниво организације може се изгубити у неспособности истраживача да контролише експериментално окружење. Табела 1 упоређује неке од карактеристика различитих ин витро система који су коришћени за проучавање хепатотоксичности.
Табела 1. Поређење ин витро система за студије хепатотоксичности
| Систем | Сложеност (ниво интеракције) |
Способност задржавања функција специфичних за јетру | Потенцијално трајање културе | Способност контроле околине |
| Овековечене ћелијске линије | од ћелије до ћелије (зависи од ћелијске линије) | лоше до добро (зависи од ћелијске линије) | неодређен | одличан |
| Примарне културе хепатоцита | ћелија до ћелије | поштено до одлично (зависи од услова културе) | дана до недеља | одличан |
| Кокултуре ћелија јетре | ћелија у ћелију (између истих и различитих типова ћелија) | добро до сјајног | недеља | одличан |
| Кришке јетре | од ћелије до ћелије (међу свим типовима ћелија) | добро до сјајног | сати до дана | добар |
| Изолована, перфузирана јетра | од ћелије до ћелије (међу свим типовима ћелија) и унутар органа | одличан | време | фер |
Прецизно исечени комади ткива се више користе за токсиколошке студије. Доступни су нови инструменти који омогућавају истраживачу да сече уједначене резове ткива у стерилном окружењу. Резови ткива нуде одређену предност у односу на системе ћелијске културе јер су присутни сви типови ћелија органа и одржавају своју архитектуру ин виво и међућелијску комуникацију. Стога, ин витро студије могу да се спроведу да би се одредио тип циљне ћелије унутар органа, као и да се испита специфична токсичност за циљни орган. Недостатак резина је што се брзо дегенеришу након прва 24 сата културе, углавном због лоше дифузије кисеоника до ћелија у унутрашњости резова. Међутим, недавне студије су показале да се ефикаснија аерација може постићи благим окретањем. Ово, заједно са употребом сложенијег медијума, омогућава да кришке преживе до 96 сати.
Експлантати ткива су по концепту слични резовима ткива и такође се могу користити за одређивање токсичности хемикалија у одређеним циљним органима. Експлантати ткива се успостављају уклањањем малог комада ткива (за студије тератогености, нетакнути ембрион) и стављањем у културу ради даљег проучавања. Културе експлантата су биле корисне за краткорочне студије токсичности укључујући иритацију и корозивност коже, студије азбеста у трахеји и студије неуротоксичности у можданом ткиву.
Изоловани перфузирани органи се такође могу користити за процену токсичности циљног органа. Ови системи нуде предност сличну оној код резова ткива и експлантата у томе што су присутни сви типови ћелија, али без стреса на ткиво унетог манипулацијама укљученим у припрему резова. Поред тога, омогућавају одржавање интеракција унутар органа. Главни недостатак је њихова краткорочна одрживост, што ограничава њихову употребу за ин витро испитивање токсичности. У смислу служења као алтернатива, ове културе се могу сматрати префињеношћу јер животиње не доживљавају штетне последице ин виво третмана токсичним супстанцама. Међутим, њихова употреба не смањује значајно број потребних животиња.
Укратко, постоји неколико типова ин витро система доступних за процену токсичности циљног органа. Могуће је добити много информација о механизмима токсичности користећи једну или више ових техника. Потешкоћа остаје у знању како да се екстраполира из ин витро система, који представља релативно мали део токсиколошког процеса, на цео процес који се одвија ин виво.
Ин витро тестови за иритацију ока
Можда најспорнији тест токсичности за целе животиње из перспективе добробити животиња је Драизеов тест за иритацију очију, који се спроводи код зечева. У овом тесту, мала фиксна доза хемикалије ставља се у једно око зеца док се друго око користи као контрола. Степен иритације и упале се оцењује у различитим временима након излагања. Улажу се велики напори да се развију методологије које ће заменити овај тест, који је критикован не само из хуманих разлога, већ и због субјективности запажања и варијабилности резултата. Занимљиво је приметити да се упркос оштрим критикама које је Драизеов тест добио, показао да је изузетно успешан у предвиђању иритација људских очију, посебно благо до умерено иритирајућих супстанци, које је тешко идентификовати другим методама. Дакле, захтеви за ин витро алтернативама су велики.
Потрага за алтернативама Драизе тесту је компликована, иако се предвиђа да ће бити успешна. Бројне ин витро и друге алтернативе су развијене иу неким случајевима су спроведене. Алтернативе префињености Драизе тесту, које су по дефиницији мање болне или узнемирујуће за животиње, укључују тест малог волумена очију, у којем се мање количине тест материјала стављају у очи зечева, не само из хуманих разлога, већ и да би ближе опонашају количине којима људи могу бити случајно изложени. Још једно прецизирање је да се супстанце које имају пХ мањи од 2 или већи од 11.5 више не тестирају на животињама јер се зна да су јако иритантне за око.
Између 1980. и 1989. године, процењено је да је број зечева који се користе за тестирање козметике на иритацију очију за 87%. Ин витро тестови су укључени као део нивоа тестирања како би се дошло до овог огромног смањења у тестовима на целим животињама. Овај приступ је процес у више корака који почиње темељним испитивањем историјских података о иритацији ока и физичко-хемијском анализом хемикалије коју треба проценити. Ако ова два процеса не дају довољно информација, онда се врши батерија ин витро тестова. Додатни подаци добијени ин витро тестовима тада могу бити довољни за процену безбедности супстанце. Ако не, онда би последњи корак био извођење ограничених ин виво тестова. Лако је видети како овај приступ може елиминисати или бар драстично смањити број животиња потребних за предвиђање безбедности испитиване супстанце.
Батерија ин витро тестова која се користи као део ове стратегије нивоа тестирања зависи од потреба одређене индустрије. Тестирање иритације очију врши се у разним индустријама, од козметике преко фармацеутских производа до индустријских хемикалија. Врста информација које захтева свака индустрија варира и стога није могуће дефинисати једну батерију ин витро тестова. Тест батерија је генерално дизајнирана да процени пет параметара: цитотоксичност, промене у физиологији и биохемији ткива, квантитативни односи структуре и активности, медијатори упале и опоравак и поправка. Пример теста за цитотоксичност, који је један од могућих узрока иритације, је неутрални црвени тест који користи култивисане ћелије (види горе). Промене у ћелијској физиологији и биохемији које су резултат излагања хемикалијама могу се испитати у културама епителних ћелија рожњаче човека. Алтернативно, истраживачи су такође користили нетакнуте или сециране говеђе или пилеће очне јабучице добијене из кланица. Многе крајње тачке мерене у овим целим културама органа су исте као оне мерене ин виво, као што су замућеност рожњаче и отицање рожњаче.
Упала је често компонента хемикалије изазване повреде ока, а постоји низ тестова који су доступни за испитивање овог параметра. Различити биохемијски тестови откривају присуство медијатора који се ослобађају током инфламаторног процеса, као што су арахидонска киселина и цитокини. Хориоалантоична мембрана (ЦАМ) кокошијег јајета се такође може користити као индикатор упале. У ЦАМ тесту, мали комад љуске пилећег ембриона од десет до 14 дана се уклања да би се открио ЦАМ. Хемикалија се затим примењује на ЦАМ и знаци упале, као што је васкуларно крварење, се бележе у различитим временима након тога.
Један од најтежих ин виво процеса за процену ин витро је опоравак и поправка повреде ока. Новоразвијени инструмент, силицијумски микрофизиометар, мери мале промене у екстрацелуларном пХ и може се користити за праћење култивисаних ћелија у реалном времену. Показало се да ова анализа прилично добро корелира са ин виво опоравком и коришћена је као ин витро тест за овај процес. Ово је био кратак преглед типова тестова који се користе као алтернативе Драизе тесту за иритацију ока. Вероватно је да ће у наредних неколико година бити дефинисана комплетна серија ин витро тест батерија и свака ће бити валидирана за своју специфичну намену.
Валидација
Кључ за регулаторно прихватање и имплементацију методологија ин витро тестирања је валидација, процес којим се утврђује кредибилитет теста кандидата за одређену сврху. Напори да се дефинише и координише процес валидације учињени су иу Сједињеним Државама иу Европи. Европска унија је основала Европски центар за валидацију алтернативних метода (ЕЦВАМ) 1993. године да би координирала напоре тамо и радила у интеракцији са америчким организацијама као што је Џон Хопкинс центар за алтернативе тестирању на животињама (ЦААТ), академски центар у Сједињеним Државама. , и Међуагенцијски координациони комитет за валидацију алтернативних метода (ИЦЦВАМ), састављен од представника Националног института за здравље, Америчке агенције за заштиту животне средине, америчке Управе за храну и лекове и Комисије за безбедност потрошачких производа.
Валидација ин витро тестова захтева значајну организацију и планирање. Мора постојати консензус међу владиним регулаторима и индустријским и академским научницима о прихватљивим процедурама, као и довољан надзор од стране научног саветодавног одбора како би се осигурало да протоколи испуњавају постављене стандарде. Студије валидације треба да се изводе у низу референтних лабораторија користећи калибрисане сетове хемикалија из хемијске банке и ћелије или ткива из једног извора. И унутарлабораторијска поновљивост и међулабораторијска поновљивост теста кандидата морају се показати, а резултати подвргнути одговарајућој статистичкој анализи. Када се сакупе резултати различитих компоненти студија валидације, научни саветодавни одбор може дати препоруке о валидности тестова кандидата за одређену сврху. Поред тога, резултате студија треба објавити у рецензираним часописима и ставити у базу података.
Дефиниција процеса валидације је тренутно у току. Свака нова студија валидације ће пружити информације корисне за дизајн следеће студије. Међународна комуникација и сарадња су од суштинског значаја за брз развој широко прихватљивог низа протокола, посебно имајући у виду повећану хитност коју намеће усвајање Директиве ЕК о козметици. Ово законодавство може заиста пружити потребан подстицај за предузимање озбиљних напора за валидацију. Тек кроз завршетак овог процеса може почети прихватање ин витро метода од стране различитих регулаторних заједница.
Zakljucak
Овај чланак је пружио широк преглед тренутног статуса испитивања токсичности ин витро. Наука о ин витро токсикологији је релативно млада, али експоненцијално расте. Изазов за наредне године је да се механичко знање генерисано ћелијским и молекуларним студијама инкорпорира у огроман ин виво података како би се обезбедио потпунији опис токсиколошких механизама, као и да се успостави парадигма по којој се подаци ин витро могу користити за предвиђање токсичности ин виво. Инхерентна вредност ових ин витро метода ће бити остварена само кроз усаглашене напоре токсиколога и представника владе.
Структура Активности Односи
Анализа односа структуре и активности (САР) је коришћење информација о молекуларној структури хемикалија за предвиђање важних карактеристика које се односе на постојаност, дистрибуцију, упијање и апсорпцију и токсичност. САР је алтернативни метод идентификације потенцијално опасних хемикалија, који обећава да ће помоћи индустријама и владама у одређивању приоритета супстанци за даљу процену или за доношење одлука у раној фази за нове хемикалије. Токсикологија је све скупљи подухват који захтева ресурсе. Повећана забринутост због потенцијала хемикалија да изазову штетне ефекте на изложену људску популацију подстакла је регулаторне и здравствене агенције да прошире опсег и осетљивост тестова за откривање токсиколошких опасности. У исто време, стварни и уочени терети регулативе за индустрију изазвали су забринутост за практичност метода испитивања токсичности и анализе података. Тренутно, одређивање хемијске канцерогености зависи од доживотног тестирања најмање две врсте, оба пола, у неколико доза, уз пажљиву хистопатолошко анализу више органа, као и детекцију пренеопластичних промена у ћелијама и циљним органима. Процењује се да у Сједињеним Државама биолошки тест рака кошта више од 3 милиона долара (1995 долара).
Чак и са неограниченим финансијским средствима, терет тестирања око 70,000 постојећих хемикалија које се данас производе у свету премашио би расположиве ресурсе обучених токсиколога. Били би потребни векови да се заврши чак и прва процена ових хемикалија (НРЦ 1984). У многим земљама етичка забринутост због употребе животиња у тестирању токсичности је порасла, што је довело до додатног притиска на употребу стандардних метода испитивања токсичности. САР се широко користи у фармацеутској индустрији за идентификацију молекула са потенцијалом за корисну употребу у лечењу (Хансцх и Зханг 1993). У политици заштите животне средине и здравља на раду, САР се користи за предвиђање дисперзије једињења у физичко-хемијском окружењу и за скрининг нових хемикалија за даљу процену потенцијалне токсичности. Према америчком Закону о контроли токсичних супстанци (ТСЦА), ЕПА је од 1979. користила САР приступ као „први екран“ нових хемикалија у процесу обавештавања о препроизводњи (ПМН); Аустралија користи сличан приступ као део своје нове процедуре обавештавања о хемикалијама (НИЦНАС). У америчкој САР анализи је важна основа за утврђивање да постоји разумна основа да се закључи да ће производња, прерада, дистрибуција, употреба или одлагање супстанце представљати неразуман ризик од повреде здравља људи или животне средине, као што се захтева у Одељку 5(ф) ТСЦА. На основу овог налаза, ЕПА онда може да захтева стварна испитивања супстанце у складу са Одељком 6 ТСЦА.
Образложење за САР
Научно образложење за САР заснива се на претпоставци да ће молекуларна структура хемикалије предвидети важне аспекте њеног понашања у физичко-хемијским и биолошким системима (Хансцх и Лео 1979).
САР процес
Процес САР прегледа укључује идентификацију хемијске структуре, укључујући емпиријске формулације, као и чисто једињење; идентификација структурно аналогних супстанци; претраживање база података и литературе за информације о структурним аналозима; и анализу токсичности и других података о структурним аналозима. У неким ретким случајевима, сама информација о структури једињења може бити довољна да подржи неку САР анализу, засновану на добро схваћеним механизмима токсичности. Састављено је неколико база података о САР-у, као и компјутерски засноване методе за предвиђање молекуларне структуре.
Са овим информацијама, следеће крајње тачке се могу проценити помоћу САР-а:
- физичко-хемијски параметри: тачка кључања, притисак паре, растворљивост у води, коефицијент расподеле октанол/вода
- биолошки/еколошки параметри судбине: биоразградња, сорпција тла, фотодеградација, фармакокинетика
- параметри токсичности: токсичност за водене организме, апсорпција, акутна токсичност за сисаре (гранични тест или ЛД50), иритација коже, плућа и очију, сензибилизација, субхронична токсичност, мутагеност.
Треба напоменути да САР методе не постоје за тако важне здравствене крајње тачке као што су карциногеност, развојна токсичност, репродуктивна токсичност, неуротоксичност, имунотоксичност или други ефекти на циљне органе. Ово је због три фактора: непостојања велике базе података на основу које би се тестирале хипотезе САР, недостатка знања о структурним детерминантама токсичног деловања и мноштва циљних ћелија и механизама који су укључени у ове крајње тачке (погледајте „Сједињене Државе приступ процени ризика од репродуктивних токсиканата и неуротоксичних агенаса”). Неки ограничени покушаји да се користи САР за предвиђање фармакокинетике коришћењем информација о коефицијентима поделе и растворљивости (Јохансон и Наслунд 1988). Екстензивнији квантитативни САР је урађен да би се предвидео П450 зависан метаболизам низа једињења и везивање молекула сличних диоксину и ПЦБ-у за цитосолни „диоксински“ рецептор (Хансцх и Зханг 1993).
Показало се да САР има различиту предвидљивост за неке од горе наведених крајњих тачака, као што је приказано у табели 1. Ова табела представља податке из два поређења предвиђене активности са стварним резултатима добијеним емпиријским мерењем или тестирањем токсичности. САР, како су га спровели стручњаци америчке ЕПА, има лошије резултате у предвиђању физичко-хемијских својстава него у предвиђању биолошке активности, укључујући биоразградњу. За крајње тачке токсичности, САР је био најбољи за предвиђање мутагености. Асхби и Теннант (1991) су у проширеној студији такође пронашли добру предвидљивост краткорочне генотоксичности у својој анализи НТП хемикалија. Ови налази нису изненађујући, имајући у виду тренутно разумевање молекуларних механизама генотоксичности (видети „Генетичка токсикологија”) и улоге електрофилности у везивању ДНК. Насупрот томе, САР је имао тенденцију да не предвиди системску и субхроничну токсичност код сисара и претерано предвиди акутну токсичност за водене организме.
Табела 1. Поређење САР и тест података: ОЕЦД/НТП анализе
| Крајња тачка | Договор (%) | Неслагање (%) | Број |
| Тачка кључања | 50 | 50 | 30 |
| Притисак паре | 63 | 37 | 113 |
| Растворљивост у води | 68 | 32 | 133 |
| Коефицијент раздвајања | 61 | 39 | 82 |
| Биоразградња | 93 | 7 | 107 |
| Токсичност рибе | 77 | 22 | 130 |
| Токсичност дафније | 67 | 33 | 127 |
| Акутна токсичност за сисаре (ЛД50 ) | 80 | 201 | 142 |
| Иритација коже | 82 | 18 | 144 |
| Иритација очију | 78 | 22 | 144 |
| Сензибилизација коже | 84 | 16 | 144 |
| Субхронична токсичност | 57 | 32 | 143 |
| Мутагеност2 | 88 | 12 | 139 |
| Мутагеност3 | КСНУМКС-КСНУМКС4 | КСНУМКС-КСНУМКС | 301 |
| Канцерогеност3 : Двогодишњи биолошки тест | КСНУМКС-КСНУМКС4 | - | 301 |
Извор: Подаци из ОЕЦД-а, лична комуникација Ц. Ауер, УС ЕПА. У овој анализи коришћене су само оне крајње тачке за које су била доступна упоредива предвиђања САР-а и стварни подаци теста. НТП подаци су од Ешбија и Тенанта 1991.
1 Забрињавајући је неуспех САР-а да предвиди акутну токсичност у 12% тестираних хемикалија.
2 Подаци ОЕЦД-а, засновани на усклађености Амесовог теста са САР
3 НТП подаци, засновани на тестовима генетских токсина у поређењу са предвиђањима САР-а за неколико класа „хемикалија које упозоравају на структуру“.
4 Усклађеност варира у зависности од класе; највећа подударност је била са ароматичним амино/нитро једињењима; најниже са „разним“ структурама.
За друге токсичне крајње тачке, као што је горе наведено, САР има мање видљиву корист. Предвиђања токсичности код сисара су компликована недостатком САР-а за токсикокинетику сложених молекула. Ипак, направљени су неки покушаји да се предложе САР принципи за комплексне крајње тачке токсичности код сисара (на пример, видети Бернстеин (1984) за САР анализу потенцијалних репродуктивних токсиканата за мушкарце). У већини случајева, база података је премала да би омогућила ригорозно тестирање предвиђања заснованих на структури.
У овом тренутку може се закључити да САР може бити користан углавном за одређивање приоритета улагања ресурса за испитивање токсичности или за рану забринутост о потенцијалној опасности. Само у случају мутагености је вероватно да се САР анализа сама по себи може поуздано користити за доношење других одлука. Ни за једну крајњу тачку није вероватно да САР може да обезбеди врсту квантитативних информација потребних за потребе процене ризика као што је дискутовано на другом месту у овом поглављу и Енциклопедија.
" ОДРИЦАЊЕ ОД ОДГОВОРНОСТИ: МОР не преузима одговорност за садржај представљен на овом веб порталу који је представљен на било ком другом језику осим енглеског, који је језик који се користи за почетну производњу и рецензију оригиналног садржаја. Одређене статистике нису ажуриране од продукција 4. издања Енциклопедије (1998).“