Kuibuka kwa teknolojia za hali ya juu katika biolojia ya molekuli na seli kumechochea mageuzi ya haraka kiasi katika sayansi ya maisha, ikiwa ni pamoja na sumu. Kwa kweli, lengo la toxicology ni kuhama kutoka kwa wanyama wote na idadi ya wanyama wote hadi seli na molekuli za wanyama binafsi na wanadamu. Tangu katikati ya miaka ya 1980, wataalam wa sumu wameanza kutumia mbinu hizi mpya katika kutathmini athari za kemikali kwenye mifumo hai. Kama maendeleo ya kimantiki, njia kama hizo zinarekebishwa kwa madhumuni ya upimaji wa sumu. Maendeleo haya ya kisayansi yamefanya kazi pamoja na mambo ya kijamii na kiuchumi ili kuleta mabadiliko katika tathmini ya usalama wa bidhaa na hatari inayoweza kutokea.

Mambo ya kiuchumi yanahusiana haswa na kiasi cha nyenzo ambazo lazima zijaribiwe. Wingi wa vipodozi vipya, dawa, dawa za kuulia wadudu, kemikali na bidhaa za nyumbani huletwa sokoni kila mwaka. Bidhaa hizi zote lazima zitathminiwe kwa uwezekano wa sumu yao. Aidha, kuna mrundikano wa kemikali ambazo tayari zinatumika ambazo hazijafanyiwa majaribio ya kutosha. Jukumu kubwa la kupata taarifa za kina za usalama juu ya kemikali hizi zote kwa kutumia mbinu za jadi za kupima wanyama litakuwa ghali katika suala la pesa na wakati, ikiwa lingeweza kutimizwa.

Pia kuna masuala ya kijamii yanayohusiana na afya na usalama wa umma, pamoja na kuongeza wasiwasi wa umma kuhusu matumizi ya wanyama kwa ajili ya kupima usalama wa bidhaa. Kuhusiana na usalama wa binadamu, vikundi vya utetezi wa maslahi ya umma na mazingira vimeweka shinikizo kubwa kwa mashirika ya serikali kutumia kanuni kali zaidi kuhusu kemikali. Mfano wa hivi majuzi umekuwa harakati za baadhi ya vikundi vya mazingira kupiga marufuku misombo ya klorini na klorini nchini Marekani. Moja ya motisha kwa hatua hiyo kali iko katika ukweli kwamba wengi wa misombo hii haijawahi kupimwa vya kutosha. Kwa mtazamo wa kitoksini, dhana ya kupiga marufuku kundi zima la kemikali tofauti kulingana na uwepo wa klorini sio sawa kisayansi na kutowajibika. Hata hivyo, inaeleweka kwamba kwa mtazamo wa umma, lazima kuwe na uhakika kwamba kemikali zinazotolewa kwenye mazingira hazileti hatari kubwa kiafya. Hali kama hiyo inasisitiza haja ya mbinu bora zaidi na za haraka za kutathmini sumu.

Wasiwasi mwingine wa kijamii ambao umeathiri eneo la upimaji wa sumu ni ustawi wa wanyama. Idadi inayoongezeka ya vikundi vya ulinzi wa wanyama ulimwenguni kote yametoa upinzani mkubwa kwa matumizi ya wanyama wote kwa majaribio ya usalama wa bidhaa. Kampeni zinazoendelea zimefanywa dhidi ya watengenezaji wa vipodozi, kaya na bidhaa za utunzaji wa kibinafsi na dawa katika majaribio ya kukomesha upimaji wa wanyama. Juhudi kama hizo barani Ulaya zimesababisha kupitishwa kwa Marekebisho ya Sita ya Maelekezo 76/768/EEC (Maelekezo ya Vipodozi). Matokeo ya Maelekezo haya ni kwamba bidhaa za vipodozi au viambato vya vipodozi ambavyo vimejaribiwa kwa wanyama baada ya Januari 1, 1998 haziwezi kuuzwa katika Umoja wa Ulaya, isipokuwa mbinu mbadala hazijathibitishwa vya kutosha. Ingawa Maelekezo haya hayana mamlaka juu ya uuzaji wa bidhaa kama hizo nchini Marekani au nchi nyingine, yataathiri kwa kiasi kikubwa makampuni hayo ambayo yana masoko ya kimataifa ambayo yanajumuisha Ulaya.

Wazo la njia mbadala, ambayo ni msingi wa ukuzaji wa majaribio isipokuwa yale ya wanyama wote, inafafanuliwa na tatu. Rs: kupunguza kwa idadi ya wanyama wanaotumiwa; uboreshaji ya itifaki ili wanyama wapate dhiki kidogo au usumbufu; na mbadala ya majaribio ya sasa ya wanyama yenye majaribio ya ndani (yaani, majaribio yaliyofanywa nje ya mnyama aliye hai), miundo ya kompyuta au majaribio ya wanyama wenye uti wa chini au spishi zisizo na uti wa mgongo. Watatu hao Rilianzishwa katika kitabu kilichochapishwa mwaka wa 1959 na wanasayansi wawili wa Uingereza, WMS Russell na Rex Burch, Kanuni za Mbinu ya Majaribio ya Kibinadamu. Russell na Burch walidumisha kwamba njia pekee ambayo matokeo halali ya kisayansi yanaweza kupatikana ni kupitia matibabu ya kibinadamu ya wanyama, na waliamini kuwa mbinu zinapaswa kutengenezwa ili kupunguza matumizi ya wanyama na hatimaye kuchukua nafasi yake. Inafurahisha, kanuni zilizoainishwa na Russell na Burch hazikuzingatiwa sana hadi kuanza tena kwa harakati za ustawi wa wanyama katikati ya miaka ya 1970. Leo dhana ya watatu Rs iko mstari wa mbele sana kuhusiana na utafiti, upimaji na elimu.

Kwa muhtasari, uundaji wa mbinu za majaribio ya vitro umeathiriwa na mambo mbalimbali ambayo yameungana katika kipindi cha miaka kumi hadi 20 iliyopita. Ni vigumu kujua ikiwa mojawapo ya mambo haya pekee yangekuwa na athari kubwa kama hiyo kwenye mikakati ya kupima sumu.

Dhana ya Vipimo vya sumu ya In Vitro

Sehemu hii itazingatia tu mbinu za in vitro za kutathmini sumu, kama mojawapo ya njia mbadala za majaribio ya wanyama wote. Njia mbadala za ziada zisizo za wanyama kama vile uundaji wa muundo wa kompyuta na uhusiano wa kiasi wa shughuli za muundo zimejadiliwa katika vifungu vingine vya sura hii.

Uchunguzi wa in vitro kwa ujumla hufanywa katika seli za wanyama au binadamu au tishu nje ya mwili. In vitro maana yake halisi ni "kwenye glasi", na inarejelea taratibu zinazofanywa kwa nyenzo hai au vifaa vya kuishi vilivyokuzwa katika vyombo vya petri au kwenye mirija ya majaribio chini ya hali maalum. Hizi zinaweza kulinganishwa na masomo ya vivo, au yale yaliyofanywa "katika mnyama aliye hai". Ingawa ni vigumu, au haiwezekani, kutabiri athari za kemikali kwenye kiumbe changamano wakati uchunguzi umefungwa kwa aina moja ya seli kwenye sahani, tafiti za ndani hutoa kiasi kikubwa cha habari kuhusu sumu ya asili pia. kama njia za seli na molekuli za sumu. Kwa kuongezea, hutoa faida nyingi juu ya tafiti za vivo kwa kuwa kwa ujumla ni za bei nafuu na zinaweza kufanywa chini ya hali zilizodhibitiwa zaidi. Zaidi ya hayo, licha ya ukweli kwamba idadi ndogo ya wanyama bado inahitajika kupata seli kwa ajili ya tamaduni za vitro, mbinu hizi zinaweza kuchukuliwa kuwa njia mbadala za kupunguza (kwani wanyama wengi wachache hutumiwa ikilinganishwa na masomo ya vivo) na mbadala za uboreshaji (kwa sababu zinaondoa hitaji). kuwaweka wanyama kwenye matokeo mabaya ya sumu yaliyowekwa na majaribio ya vivo).

Ili kutafsiri matokeo ya vipimo vya sumu ya vitro, kuamua umuhimu wao katika kutathmini sumu na kuhusisha mchakato wa jumla wa kitoksini katika vivo, ni muhimu kuelewa ni sehemu gani ya mchakato wa kitoksini inayochunguzwa. Mchakato mzima wa kitoksini unajumuisha matukio ambayo huanza na mfiduo wa kiumbe kwa wakala wa kimwili au kemikali, maendeleo kupitia mwingiliano wa seli na molekuli na hatimaye kujidhihirisha wenyewe katika majibu ya viumbe vyote. Vipimo vya in vitro kwa ujumla ni mdogo kwa sehemu ya mchakato wa kitoksini unaofanyika katika kiwango cha seli na molekuli. Aina za taarifa zinazoweza kupatikana kutokana na tafiti za ndani ni pamoja na njia za kimetaboliki, mwingiliano wa metabolites hai zenye shabaha za seli na molekuli na viambajengo vya sumu vinavyoweza kupimika ambavyo vinaweza kutumika kama viashirio vya molekuli vya kufichuliwa. Katika hali nzuri, utaratibu wa sumu ya kila kemikali kutoka kwa kufichuliwa kwa udhihirisho wa kiumbe utajulikana, ili habari iliyopatikana kutoka kwa vipimo vya ndani inaweza kufasiriwa kikamilifu na kuhusiana na mwitikio wa kiumbe kizima. Walakini, hii haiwezekani, kwani ni mifumo michache kamili ya kitoksini imefafanuliwa. Kwa hivyo, wataalam wa sumu wanakabiliwa na hali ambayo matokeo ya mtihani wa vitro hayawezi kutumika kama utabiri sahihi kabisa wa sumu ya vivo kwa sababu utaratibu haujulikani. Hata hivyo, mara kwa mara wakati wa mchakato wa kuunda mtihani wa ndani, vipengele vya utaratibu wa seli na molekuli za sumu hufafanuliwa.

Mojawapo ya maswala muhimu ambayo hayajatatuliwa yanayozunguka ukuzaji na utekelezaji wa majaribio ya ndani yanahusiana na kuzingatia: je, yanapaswa kuwa ya msingi au inatosha kuwa ya maelezo? Ni bora bila ubishi kutoka kwa mtazamo wa kisayansi kutumia majaribio yanayotegemea kikanika pekee kama vibadala vya majaribio ya vivo. Walakini kwa kukosekana kwa maarifa kamili ya fundi, matarajio ya kukuza vipimo vya vitro kuchukua nafasi ya vipimo vya wanyama wote katika siku za usoni ni karibu hakuna. Hii, hata hivyo, haiondoi matumizi ya aina za ufafanuzi zaidi kama zana za uchunguzi wa mapema, ambayo ni kesi kwa sasa. Skrini hizi zimesababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa matumizi ya wanyama. Kwa hivyo, hadi wakati ambapo maelezo zaidi ya kiufundi yanatolewa, inaweza kuwa muhimu kuajiri kwa kiwango kidogo zaidi, majaribio ambayo matokeo yake yanahusiana vyema na yale yaliyopatikana katika vivo.

Vipimo vya Vitro vya Cytotoxicity

Katika sehemu hii, majaribio kadhaa ya ndani ambayo yametengenezwa ili kutathmini uwezo wa cytotoxic wa kemikali yataelezwa. Kwa sehemu kubwa, majaribio haya ni rahisi kufanya na uchambuzi unaweza kuwa wa kiotomatiki. Jaribio la kawaida la in vitro kwa cytotoxicity ni kipimo chekundu kisicho na upande. Upimaji huu unafanywa kwenye seli katika utamaduni, na kwa matumizi mengi, seli zinaweza kudumishwa katika sahani za utamaduni ambazo zina visima vidogo 96, kila kipenyo cha 6.4mm. Kwa kuwa kila kisima kinaweza kutumika kwa uamuzi mmoja, mpangilio huu unaweza kukidhi viwango vingi vya kemikali ya majaribio pamoja na vidhibiti chanya na hasi vyenye idadi ya kutosha ya nakala kwa kila moja. Kufuatia matibabu ya seli zilizo na viwango mbalimbali vya kemikali ya majaribio kuanzia angalau oda mbili za ukubwa (kwa mfano, kutoka 0.01mM hadi 1mM), pamoja na kemikali chanya na hasi za kudhibiti, seli huoshwa na kutibiwa na nyekundu isiyo na upande, a. rangi ambayo inaweza kuchukuliwa na kubakiwa na seli hai pekee. Rangi inaweza kuongezwa baada ya kuondolewa kwa kemikali ya majaribio ili kubaini athari za mara moja, au inaweza kuongezwa kwa nyakati tofauti baada ya kemikali ya majaribio kuondolewa ili kubaini madhara limbikizi au kuchelewa. Uzito wa rangi katika kila kisima hulingana na idadi ya seli hai kwenye kisima hicho. Uzito wa rangi hupimwa kwa spectrophotometer ambayo inaweza kuwa na kisoma sahani. Msomaji wa sahani amepangwa kutoa vipimo vya mtu binafsi kwa kila moja ya visima 96 vya sahani ya utamaduni. Mbinu hii ya kiotomatiki huruhusu mpelelezi kufanya kwa haraka jaribio la kujibu umakini na kupata data muhimu kitakwimu.

Uchunguzi mwingine rahisi wa cytotoxicity ni mtihani wa MTT. MTT (3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromidi) ni rangi ya tetrazoli ambayo hupunguzwa na vimeng'enya vya mitochondrial hadi rangi ya buluu. Seli zilizo na mitochondria inayoweza kutumika ndizo zitabaki na uwezo wa kutekeleza majibu haya; kwa hiyo ukubwa wa rangi unahusiana moja kwa moja na kiwango cha uadilifu wa mitochondrial. Hili ni jaribio muhimu la kugundua misombo ya jumla ya sitotoxic na vile vile mawakala ambao hulenga mitochondria.

Kipimo cha shughuli ya lactate dehydrogenase (LDH) pia hutumika kama kipimo cha msingi cha sitotoxicity. Kimeng'enya hiki kwa kawaida kipo kwenye saitoplazimu ya chembe hai na hutolewa katika njia ya utamaduni wa seli kupitia utando wa seli unaovuja wa seli zilizokufa au zinazokufa ambazo zimeathiriwa vibaya na wakala wa sumu. Kiasi kidogo cha njia ya kitamaduni kinaweza kuondolewa kwa nyakati tofauti baada ya matibabu ya kemikali ya seli ili kupima kiwango cha LDH iliyotolewa na kuamua muda wa sumu. Ingawa jaribio la kutolewa kwa LDH ni tathmini ya jumla sana ya cytotoxicity, ni muhimu kwa sababu ni rahisi kutekeleza na inaweza kufanywa kwa wakati halisi.

Kuna njia nyingi mpya zinazotengenezwa ili kugundua uharibifu wa seli. Mbinu za kisasa zaidi hutumia uchunguzi wa umeme kupima anuwai ya vigezo vya ndani ya seli, kama vile kutolewa kwa kalsiamu na mabadiliko ya pH na uwezo wa utando. Kwa ujumla, uchunguzi huu ni nyeti sana na unaweza kutambua mabadiliko fiche zaidi ya seli, hivyo basi kupunguza hitaji la kutumia kifo cha seli kama mwisho. Kwa kuongeza, nyingi za majaribio haya ya fluorescent yanaweza kujiendesha kwa kutumia sahani za visima 96 na visoma sahani za fluorescent.

Baada ya data kukusanywa juu ya mfululizo wa kemikali kwa kutumia mojawapo ya majaribio haya, sumu ya jamaa inaweza kutambuliwa. Sumu ya jamaa ya kemikali, kama inavyobainishwa katika jaribio la ndani, inaweza kuonyeshwa kama ukolezi unaoleta athari ya 50% kwenye mwitikio wa mwisho wa seli ambazo hazijatibiwa. Uamuzi huu unajulikana kama EC₅₀ (Eyenye ufanisi Concentration kwa 50% ya seli) na inaweza kutumika kulinganisha sumu ya kemikali tofauti katika vitro. (Neno kama hilo linalotumika katika kutathmini kiwango cha sumu ni IC₅₀, ikionyesha mkusanyiko wa kemikali ambayo husababisha kizuizi cha 50% cha mchakato wa seli, kwa mfano, uwezo wa kuchukua nyekundu isiyo na upande.) Si rahisi kutathmini ikiwa sumu ya jamaa katika vitro ya kemikali inalinganishwa na jamaa zao katika Vivo sumu, kwa kuwa kuna mambo mengi ya kutatanisha katika mfumo wa vivo, kama vile toxicokinetics, metaboli, ukarabati na taratibu za ulinzi. Kwa kuongezea, kwa kuwa nyingi za majaribio haya hupima ncha za jumla za sitotoxicity, hazitegemei kikanika. Kwa hivyo, makubaliano kati ya sumu ya vitro na vivo ni uhusiano tu. Licha ya ugumu mwingi na ugumu wa kuzidisha kutoka kwa vitro hadi kwenye vivo, majaribio haya ya ndani yanaonekana kuwa ya thamani sana kwa sababu ni rahisi na ya bei rahisi kutekeleza na yanaweza kutumika kama skrini kuashiria dawa au kemikali zenye sumu kali katika hatua za mwanzo za maendeleo.

Sumu ya Organ inayolengwa

Vipimo vya in vitro pia vinaweza kutumika kutathmini sumu ya kiungo kinacholengwa. Kuna idadi ya matatizo yanayohusiana na kubuni vipimo hivyo, inayojulikana zaidi ni kutokuwa na uwezo wa mifumo ya vitro kudumisha vipengele vingi vya chombo katika vivo. Mara kwa mara, seli zinapochukuliwa kutoka kwa wanyama na kuwekwa kwenye utamaduni, huwa aidha huharibika haraka na/au kutengana, yaani, kupoteza utendaji wao kama wa kiungo na kuwa generic zaidi. Hii inaleta tatizo kwa kuwa ndani ya muda mfupi, kwa kawaida siku chache, tamaduni hazifai tena kutathmini athari za sumu kwenye kiungo.

Mengi ya matatizo haya yanatatuliwa kwa sababu ya maendeleo ya hivi majuzi katika biolojia ya molekuli na seli. Taarifa zinazopatikana kuhusu mazingira ya seli katika vivo zinaweza kutumika katika kurekebisha hali ya utamaduni katika vitro. Tangu katikati ya miaka ya 1980, sababu mpya za ukuaji na saitokini zimegunduliwa, na nyingi kati ya hizi sasa zinapatikana kibiashara. Ongezeko la vipengele hivi kwa seli katika utamaduni husaidia kuhifadhi uadilifu wao na pia kunaweza kusaidia kuhifadhi utendaji tofauti zaidi kwa muda mrefu. Masomo mengine ya msingi yameongeza ujuzi wa mahitaji ya lishe na homoni ya seli katika utamaduni, ili vyombo vya habari vipya vitengenezwe. Maendeleo ya hivi majuzi pia yamefanywa katika kutambua matiti ya asili na bandia ya ziada ambayo seli zinaweza kukuzwa. Utamaduni wa seli kwenye matiti hizi tofauti unaweza kuwa na athari kubwa kwa muundo na utendaji wao. Faida kuu inayotokana na ujuzi huu ni uwezo wa kudhibiti kwa ustadi mazingira ya seli katika utamaduni na kuchunguza kibinafsi athari za mambo haya kwenye michakato ya msingi ya seli na juu ya majibu yao kwa mawakala tofauti wa kemikali. Kwa kifupi, mifumo hii inaweza kutoa ufahamu mkubwa juu ya mifumo mahususi ya chombo cha sumu.

Masomo mengi ya sumu ya viungo hulengwa katika seli za msingi, ambazo kwa ufafanuzi zimetengwa hivi karibuni kutoka kwa chombo, na kwa kawaida huonyesha maisha mafupi katika utamaduni. Kuna faida nyingi za kuwa na tamaduni za msingi za aina ya seli moja kutoka kwa chombo kwa ajili ya tathmini ya sumu. Kutoka kwa mtazamo wa kiufundi, tamaduni kama hizo ni muhimu kwa kusoma shabaha maalum za seli za kemikali. Katika baadhi ya matukio, aina mbili au zaidi za seli kutoka kwa kiungo zinaweza kukuzwa pamoja, na hii inatoa faida zaidi ya kuweza kuangalia mwingiliano wa seli katika kukabiliana na sumu. Baadhi ya mifumo ya tamaduni shirikishi ya ngozi imeundwa ili kuunda muundo wa pande tatu unaofanana na ngozi katika vivo. Inawezekana pia kukuza seli kutoka kwa viungo tofauti - kwa mfano, ini na figo. Utamaduni wa aina hii unaweza kuwa muhimu katika kutathmini athari mahususi kwa seli za figo, za kemikali ambayo lazima iwe imeamilishwa kwenye ini.

Zana za kibaolojia za molekuli pia zimekuwa na jukumu muhimu katika uundaji wa mistari ya seli ambayo inaweza kuwa muhimu kwa kupima sumu ya chombo kinacholengwa. Mistari hii ya seli huzalishwa kwa kuhamisha DNA hadi kwenye seli za msingi. Katika utaratibu wa uhamishaji, seli na DNA hutibiwa hivi kwamba DNA inaweza kuchukuliwa na seli. DNA kwa kawaida hutoka kwa virusi na huwa na jeni au jeni ambazo, zinapoonyeshwa, huruhusu seli kutokufa (yaani, kuweza kuishi na kukua kwa muda mrefu katika utamaduni). DNA pia inaweza kutengenezwa ili jeni isiyoweza kufa idhibitiwe na mkuzaji asiyeweza kubadilika. Faida ya aina hii ya uundaji ni kwamba seli zitagawanyika tu wakati zinapokea kichocheo kinachofaa cha kemikali ili kuruhusu kujieleza kwa jeni isiyoweza kufa. Mfano wa muundo kama huo ni jeni kubwa ya antijeni ya T kutoka kwa Virusi vya Simian 40 (SV40) (jeni isiyoweza kufa), ikitanguliwa na eneo la mkuzaji wa jeni la metallothionein, ambalo huchochewa na uwepo wa chuma katika media ya kitamaduni. Kwa hivyo, baada ya jeni kuhamishiwa kwenye seli, seli zinaweza kutibiwa kwa viwango vya chini vya zinki ili kumsisimua mtangazaji wa MT na kuwasha usemi wa jeni ya antijeni ya T. Chini ya hali hizi, seli huongezeka. Wakati zinki inapoondolewa kutoka kwa kati, seli huacha kugawanyika na chini ya hali nzuri hurudi kwenye hali ambapo zinaelezea kazi zao maalum za tishu.

Uwezo wa kuzalisha seli zisizoweza kufa pamoja na maendeleo katika teknolojia ya utamaduni wa seli umechangia pakubwa katika uundaji wa mistari ya seli kutoka kwa viungo vingi tofauti, ikiwa ni pamoja na ubongo, figo na ini. Hata hivyo, kabla ya mistari hii ya seli inaweza kutumika kama mbadala wa aina halisi za seli, lazima zibainishwe kwa uangalifu ili kubaini jinsi zilivyo "kawaida".

Mifumo mingine ya in vitro ya kusoma sumu ya viungo inayolengwa inahusisha kuongezeka kwa utata. Mifumo ya in vitro inapoendelea katika uchangamano kutoka kwa seli moja hadi utamaduni wa kiungo kizima, huwa inalinganishwa zaidi na mazingira ya ndani, lakini wakati huo huo inakuwa vigumu zaidi kudhibiti kutokana na kuongezeka kwa idadi ya vigeuzo. Kwa hivyo, kile kinachoweza kupatikana katika kuhamia kiwango cha juu cha shirika kinaweza kupotea kwa kutokuwa na uwezo wa mtafiti kudhibiti mazingira ya majaribio. Jedwali la 1 linalinganisha baadhi ya sifa za mifumo mbalimbali ya in vitro ambayo imetumika kuchunguza hepatotoxicity.

Jedwali 1. Ulinganisho wa mifumo ya vitro kwa masomo ya hepatotoxicity

Vipande vya tishu vilivyokatwa kwa usahihi vinatumiwa zaidi kwa masomo ya kitoksini. Kuna vifaa vipya vinavyomwezesha mtafiti kukata vipande vya tishu sare katika mazingira tasa. Vipande vya tishu hutoa faida fulani juu ya mifumo ya utamaduni wa seli kwa kuwa aina zote za seli za kiungo zipo na hudumisha usanifu wao wa vivo na mawasiliano kati ya seli. Kwa hivyo, tafiti za in vitro zinaweza kufanywa ili kubaini aina ya seli inayolengwa ndani ya chombo na pia kuchunguza sumu ya kiungo kinacholengwa. Hasara ya vipande ni kwamba hupungua kwa kasi baada ya masaa 24 ya kwanza ya utamaduni, hasa kutokana na kuenea kwa oksijeni kwa seli kwenye mambo ya ndani ya vipande. Hata hivyo, tafiti za hivi majuzi zimeonyesha kuwa upenyezaji hewa unaofaa zaidi unaweza kupatikana kwa kuzunguka kwa upole. Hii, pamoja na utumiaji wa njia ngumu zaidi, inaruhusu vipande kuishi hadi masaa 96.

Vipandikizi vya tishu vinafanana kimawazo na vipande vya tishu na vinaweza pia kutumiwa kubainisha sumu ya kemikali katika viungo maalum vinavyolengwa. Vipandikizi vya tishu huanzishwa kwa kuondoa kipande kidogo cha tishu (kwa masomo ya teratogenicity, kiinitete kisichoharibika) na kukiweka kwenye utamaduni kwa masomo zaidi. Tamaduni za vipandikizi zimekuwa muhimu kwa tafiti za muda mfupi za sumu ikijumuisha mwasho na ulikaji kwenye ngozi, tafiti za asbesto katika trachea na tafiti za sumu ya neva katika tishu za ubongo.

Viungo vilivyotengwa vilivyo na manukato vinaweza pia kutumiwa kutathmini sumu ya kiungo kinacholengwa. Mifumo hii hutoa faida sawa na ile ya vipande vya tishu na vipandikizi kwa kuwa aina zote za seli zipo, lakini bila mkazo wa tishu unaoletwa na ghiliba zinazohusika katika kuandaa vipande. Aidha, wao kuruhusu kwa ajili ya matengenezo ya mwingiliano wa ndani ya chombo. Hasara kubwa ni uwezo wao wa muda mfupi, ambao unazuia matumizi yao kwa kupima sumu ya vitro. Kwa upande wa kutumika kama mbadala, tamaduni hizi zinaweza kuchukuliwa kuwa uboreshaji kwa vile wanyama hawapati matokeo mabaya ya matibabu ya vivo na sumu. Walakini, matumizi yao hayapunguzi sana idadi ya wanyama wanaohitajika.

Kwa muhtasari, kuna aina kadhaa za mifumo ya in vitro inayopatikana kwa kutathmini sumu ya chombo kinacholengwa. Inawezekana kupata habari nyingi juu ya mifumo ya sumu kwa kutumia moja au zaidi ya mbinu hizi. Ugumu unabaki katika kujua jinsi ya kuongeza kutoka kwa mfumo wa vitro, ambao unawakilisha sehemu ndogo ya mchakato wa kitoksini, hadi mchakato mzima unaotokea katika vivo.

Vipimo vya In Vitro kwa Mwasho wa Ocular

Labda jaribio lenye utata zaidi la sumu ya mnyama mzima kutoka kwa mtazamo wa ustawi wa wanyama ni jaribio la Draize la kuwasha macho, ambalo hufanywa kwa sungura. Katika jaribio hili, kipimo kidogo kisichobadilika cha kemikali huwekwa kwenye jicho moja la sungura huku jicho lingine likitumika kama kidhibiti. Kiwango cha kuwasha na kuvimba hupigwa kwa nyakati tofauti baada ya kufichuliwa. Juhudi kubwa inafanywa kutengeneza mbinu za kuchukua nafasi ya mtihani huu, ambao umekosolewa sio tu kwa sababu za kibinadamu, lakini pia kwa sababu ya kuzingatia na kubadilika kwa matokeo. Inafurahisha kutambua kwamba licha ya ukosoaji mkali ambao mtihani wa Draize umepokea, umethibitishwa kuwa na mafanikio ya ajabu katika kutabiri viwasho vya macho ya binadamu, hasa vitu vya kuwasha kidogo hadi kwa kiasi, ambavyo ni vigumu kuvitambua kwa mbinu nyinginezo. Kwa hivyo, mahitaji ya njia mbadala za vitro ni kubwa.

Tamaa ya kutafuta mbadala wa jaribio la Draize ni ngumu, ingawa inatabiriwa kufaulu. Njia nyingi za in vitro na zingine zimetengenezwa na katika hali zingine zimetekelezwa. Njia mbadala za uboreshaji kwa mtihani wa Draize, ambao kwa ufafanuzi, hauna uchungu au uchungu kwa wanyama, ni pamoja na Jaribio la Macho la Kiasi cha Chini, ambapo kiasi kidogo cha vifaa vya mtihani huwekwa machoni pa sungura, sio tu kwa sababu za kibinadamu, lakini kuiga kwa karibu zaidi kiasi ambacho watu wanaweza kuonyeshwa kwa bahati mbaya. Uboreshaji mwingine ni kwamba vitu ambavyo vina pH chini ya 2 au zaidi ya 11.5 havijaribiwi tena kwa wanyama kwa vile vinajulikana kuwasha sana jicho.

Kati ya 1980 na 1989, kumekuwa na wastani wa 87% kupungua kwa idadi ya sungura wanaotumiwa kwa uchunguzi wa kuwasha kwa macho ya vipodozi. Vipimo vya in vitro vimejumuishwa kama sehemu ya mbinu ya kupima viwango ili kuleta upunguzaji huu mkubwa wa majaribio ya wanyama wote. Mbinu hii ni mchakato wa hatua nyingi ambao huanza na uchunguzi wa kina wa data ya kihistoria ya muwasho wa macho na uchambuzi wa kimwili na kemikali wa kemikali utakaotathminiwa. Ikiwa michakato hii miwili haitoi habari ya kutosha, basi betri ya vipimo vya in vitro inafanywa. Data ya ziada iliyopatikana kutoka kwa majaribio ya ndani inaweza kutosha kutathmini usalama wa dutu hii. Ikiwa sivyo, basi hatua ya mwisho itakuwa kufanya majaribio machache ya vivo. Ni rahisi kuona jinsi mbinu hii inaweza kuondoa au angalau kupunguza kwa kiasi kikubwa idadi ya wanyama wanaohitajika kutabiri usalama wa dutu ya majaribio.

Betri ya majaribio ya ndani ambayo hutumiwa kama sehemu ya mkakati huu wa kupima kiwango hutegemea mahitaji ya tasnia mahususi. Upimaji wa muwasho wa macho hufanywa na tasnia mbali mbali kutoka kwa vipodozi hadi dawa hadi kemikali za viwandani. Aina ya taarifa inayohitajika kwa kila sekta inatofautiana na kwa hivyo haiwezekani kufafanua betri moja ya majaribio ya ndani. Betri ya majaribio kwa ujumla imeundwa kutathmini vigezo vitano: cytotoxicity, mabadiliko ya fiziolojia ya tishu na biokemia, uhusiano wa kiasi wa shughuli za muundo, vipatanishi vya kuvimba, na urejeshaji na ukarabati. Mfano wa uchunguzi wa cytotoxicity, ambayo ni sababu mojawapo ya mwasho, ni kipimo chekundu kisichoegemea upande wowote kwa kutumia seli zilizokuzwa (tazama hapo juu). Mabadiliko katika fiziolojia ya seli na biokemia kutokana na kukabiliwa na kemikali yanaweza kujaribiwa katika tamaduni za seli za epithelial za corneal. Vinginevyo, wachunguzi pia wametumia mboni za ng'ombe au kuku zilizokatwa au zilizokatwa zilizopatikana kutoka kwa machinjio. Nyingi za ncha zilizopimwa katika tamaduni hizi zote za viungo ni sawa na zile zinazopimwa katika vivo, kama vile uwazi wa konea na uvimbe wa konea.

Kuvimba mara kwa mara ni sehemu ya jeraha la jicho linalosababishwa na kemikali, na kuna idadi ya vipimo vinavyopatikana ili kuchunguza kigezo hiki. Uchambuzi mbalimbali wa biokemikali hugundua kuwepo kwa wapatanishi iliyotolewa wakati wa mchakato wa uchochezi kama vile asidi arachidonic na cytokines. Utando wa chorioallantoic (CAM) wa yai la kuku pia unaweza kutumika kama kiashiria cha kuvimba. Katika tathmini ya CAM, kipande kidogo cha ganda la kiinitete cha kifaranga cha siku kumi hadi 14 kinatolewa ili kufichua CAM. Kemikali hiyo inawekwa kwenye CAM na ishara za kuvimba, kama vile kutokwa na damu kwa mishipa, hupigwa kwa nyakati tofauti baada ya hapo.

Mojawapo ya michakato ngumu zaidi ya kutathmini katika vitro ni kupona na kurekebisha jeraha la jicho. Chombo kipya kilichoundwa, maikrofiziomita ya silicon, hupima mabadiliko madogo katika pH ya seli na inaweza kutumika kufuatilia seli zilizokuzwa kwa wakati halisi. Uchanganuzi huu umeonyeshwa kuwa unahusiana vyema na urejeshaji katika vivo na umetumika kama jaribio la ndani kwa mchakato huu. Huu umekuwa muhtasari mfupi wa aina za majaribio yanayotumika kama njia mbadala ya mtihani wa Draize kwa mwasho wa macho. Kuna uwezekano kwamba ndani ya miaka kadhaa ijayo mfululizo kamili wa betri za majaribio ya vitro utafafanuliwa na kila moja itathibitishwa kwa madhumuni yake mahususi.

Uthibitishaji

Ufunguo wa kukubalika kwa udhibiti na utekelezaji wa mbinu za mtihani wa vitro ni uthibitishaji, mchakato ambao uaminifu wa mtihani wa mtahiniwa huanzishwa kwa madhumuni maalum. Juhudi za kufafanua na kuratibu mchakato wa uthibitishaji zimefanywa nchini Marekani na Ulaya. Umoja wa Ulaya ulianzisha Kituo cha Ulaya cha Uthibitishaji wa Mbinu Mbadala (ECVAM) mwaka wa 1993 ili kuratibu juhudi huko na kuingiliana na mashirika ya Marekani kama vile Kituo cha Johns Hopkins cha Njia Mbadala za Kupima Wanyama (CAAT), kituo cha kitaaluma nchini Marekani. , na Kamati ya Kuratibu ya Mashirika ya Kimataifa ya Uthibitishaji wa Mbinu Mbadala (ICCVAM), inayojumuisha wawakilishi kutoka Taasisi za Kitaifa za Afya, Wakala wa Ulinzi wa Mazingira wa Marekani, Utawala wa Chakula na Dawa wa Marekani na Tume ya Usalama ya Bidhaa za Watumiaji.

Uthibitishaji wa vipimo vya in vitro unahitaji shirika na mipango kubwa. Lazima kuwe na maelewano kati ya wadhibiti wa serikali na wanasayansi wa viwanda na wasomi juu ya taratibu zinazokubalika, na uangalizi wa kutosha wa bodi ya ushauri wa kisayansi ili kuhakikisha kuwa itifaki zinafikia viwango vilivyowekwa. Masomo ya uthibitishaji yanapaswa kufanywa katika mfululizo wa maabara za marejeleo kwa kutumia seti zilizorekebishwa za kemikali kutoka kwa benki ya kemikali na seli au tishu kutoka chanzo kimoja. Kujirudia kwa ndani ya maabara na uundaji tena wa kimaabara wa mtihani wa mtahiniwa lazima waonyeshwe na matokeo yachanganue takwimu zinazofaa. Mara tu matokeo kutoka kwa vipengele tofauti vya tafiti za uthibitishaji yanapokusanywa, bodi ya ushauri ya kisayansi inaweza kutoa mapendekezo kuhusu uhalali wa (ma)jaribio ya watahiniwa kwa madhumuni mahususi. Kwa kuongezea, matokeo ya tafiti yanapaswa kuchapishwa katika majarida yaliyopitiwa na rika na kuwekwa kwenye hifadhidata.

Ufafanuzi wa mchakato wa uthibitishaji kwa sasa ni kazi inayoendelea. Kila utafiti mpya wa uthibitishaji utatoa taarifa muhimu kwa muundo wa utafiti unaofuata. Mawasiliano na ushirikiano wa kimataifa ni muhimu kwa maendeleo ya haraka ya mfululizo wa itifaki zinazokubalika kwa wingi, hasa kutokana na kuongezeka kwa uharaka uliowekwa na kupitishwa kwa Maelekezo ya EC Vipodozi. Sheria hii inaweza kweli kutoa msukumo unaohitajika kwa juhudi kubwa ya uthibitishaji kufanywa. Ni kwa kukamilika kwa mchakato huu tu ndipo kukubalika kwa mbinu za ndani na jumuiya mbalimbali za udhibiti kunaweza kuanza.

Hitimisho

Nakala hii imetoa muhtasari mpana wa hali ya sasa ya upimaji wa sumu katika vitro. Sayansi ya toxicology in vitro ni changa, lakini inakua kwa kasi. Changamoto kwa miaka ijayo ni kujumuisha maarifa ya kiufundi yanayotokana na tafiti za seli na molekuli katika orodha kubwa ya data ya vivo ili kutoa maelezo kamili zaidi ya mifumo ya kitoksini na pia kuanzisha dhana ambayo data ya vitro inaweza kutumika. kutabiri sumu katika vivo. Itakuwa tu kupitia juhudi za pamoja za wataalam wa sumu na wawakilishi wa serikali kwamba thamani ya asili ya njia hizi za ndani inaweza kupatikana.

Back