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毒理學測試方法

週日,一月16 2011:18 45

生物標誌物

生物標誌物 是 biological marker 的縮寫,該術語指的是發生在生物系統(例如人體)中的可測量事件。 然後,該事件被解釋為有機體或預期壽命的更一般狀態的反映或標記。 在職業健康中,生物標誌物通常被用作健康狀況或疾病風險的指標。

生物標誌物用於可能包括人類的體外和體內研究。 通常,確定了三種特定類型的生物標記。 儘管一些生物標誌物可能難以分類,但通常將它們分為暴露生物標誌物、效應生物標誌物或易感性生物標誌物(見表 1)。

表 1. 職業健康毒理學研究中使用的暴露生物標誌物或影響生物標誌物示例

樣本 測量 目標
暴露生物標誌物
脂肪組織 二噁英 二噁英暴露
領導 鉛接觸
鋁暴露
呼出一口氣 甲苯 接觸甲苯
美髮護理 水星 甲基汞暴露
精華 苯暴露
尿 苯酚 苯暴露
效應生物標誌物
碳氧血紅蛋白 一氧化碳暴露
紅細胞 鋅原卟啉 鉛接觸
精華 膽鹼酯酶 接觸有機磷
尿 微球蛋白 腎毒性暴露
白血細胞 DNA加合物 誘變劑暴露

 

給定可接受的有效性程度,生物標誌物可用於多種目的。 在個體基礎上,生物標誌物可用於支持或反駁特定類型的中毒或其他化學引起的不良反應的診斷。 在健康受試者中,生物標誌物還可以反映個體對特定化學物質暴露的過敏性,因此可以作為風險預測和諮詢的基礎。 在暴露的工人群體中,可以應用一些暴露生物標誌物來評估對污染減排法規的遵守程度或一般預防工作的有效性。

暴露的生物標誌物

暴露生物標誌物可以是體內的外源性化合物(或代謝物)、化合物(或代謝物)與內源性成分之間的相互作用產物,或與暴露相關的其他事件。 最常見的是,暴露於穩定化合物(例如金屬)的生物標誌物包括對適當樣品(例如血液、血清或尿液)中金屬濃度的測量。 對於揮發性化學品,可以評估它們在呼出氣中的濃度(吸入無污染空氣後)。 如果化合物在體內代謝,可選擇一種或多種代謝物作為暴露的生物標誌物; 代謝物通常在尿樣中測定。

現代分析方法可以分離有機化合物的異構體或同系物,以及確定金屬化合物的形態或某些元素的同位素比率。 複雜的分析可以確定因與反應性化學物質結合而引起的 DNA 或其他大分子結構的變化。 此類先進技術無疑將在生物標誌物研究中的應用中獲得相當大的重要性,並且較低的檢測限和更好的分析有效性可能會使這些生物標誌物更加有用。

暴露於致突變化學品的生物標誌物出現了特別有前途的發展。 這些化合物具有反應性,可與蛋白質或 DNA 等大分子形成加合物。 可在白細胞或組織活檢中檢測到 DNA 加合物,特定的 DNA 片段可從尿液中排出。 例如,暴露於環氧乙烷會導致與 DNA 鹼基發生反應,並且在切除受損鹼基後,N-7-(2-羥乙基)鳥嘌呤會從尿液中消失。 一些加合物可能不直接指特定的暴露。 例如,8-hydroxy-2'-deoxyguanosine 反映了 DNA 的氧化損傷,這種反應可能由幾種化合物觸發,其中大部分也會誘導脂質過氧化。

其他大分子也可能因加合物形成或氧化而發生變化。 特別令人感興趣的是,此類反應性化合物可能會產生血紅蛋白加合物,可將其確定為暴露於這些化合物的生物標誌物。 優點是可以從血液樣本中獲得大量的血紅蛋白,並且考慮到紅細胞的四個月壽命,與蛋白質氨基酸形成的加合物將表明在此期間的總暴露量。

加合物可通過高效脂質色譜等靈敏技術測定,也可使用一些免疫學方法。 一般來說,分析方法是新的、昂貴的,需要進一步開發和驗證。 更好的靈敏度可以通過使用獲得 32P 標記後測定,這是發生 DNA 損傷的非特異性指示。 所有這些技術都可能對生物監測有用,並已應用於越來越多的研究中。 然而,需要更簡單和更靈敏的分析方法。 鑑於某些方法在低水平暴​​露下的特異性有限,吸煙或其他因素可能會對測量結果產生重大影響,從而造成解釋困難。

暴露於致突變化合物,或暴露於代謝成誘變劑的化合物,也可以通過評估來自暴露個體的尿液的致突變性來確定。 尿液樣本與一株細菌一起孵育,其中特定點突變以易於測量的方式表達。 如果尿液樣本中存在致突變化學物質,那麼細菌的突變率就會增加。

必鬚根據暴露的時間變化和與不同隔間的關係來評估暴露生物標誌物。 因此,生物標誌物代表的時間範圍,即生物標誌物測量反映過去暴露和/或累積身體負荷的程度,必鬚根據毒代動力學數據確定,以便解釋結果。 特別是,應考慮生物標誌物指示在特定目標器官中保留的程度。 儘管血液樣本通常用於生物標誌物研究,但外周血通常不被視為隔室,儘管它充當隔室之間的傳輸介質。 血液中濃度反映不同器官水平的程度因不同化學物質而異,通常還取決於接觸時間的長短以及接觸後的時間。

有時,此類證據用於將生物標誌物分類為(總)吸收劑量指標或有效劑量指標(即已到達靶組織的量)。 例如,可以根據暴露後特定時間血液中溶劑的實際濃度數據來評估對特定溶劑的暴露。 該測量值將反映已被吸收到體內的溶劑量。 由於溶劑的蒸氣壓,一些被吸收的量將被呼出。 在血液中循環時,溶劑會與身體的各種成分相互作用,最終會被酶分解。 代謝過程的結果可以通過確定與穀胱甘肽結合產生的特定硫醇尿酸來評估。 硫醇尿酸的累積排泄可能比血藥濃度更好地反映有效劑量。

生命事件,例如繁殖和衰老,可能會影響化學物質的分佈。 懷孕會顯著影響化學物質在體內的分佈,許多化學物質可能會通過胎盤屏障,從而導致胎兒暴露。 哺乳可能會導致脂溶性化學物質的排泄,從而導致母親體內的保留減少以及嬰兒的吸收增加。 在體重減輕或骨質疏鬆症發展過程中,儲存的化學物質可能會被釋放,然後可能導致目標器官重新和長期的“內源性”暴露。 其他因素可能會影響化合物的個體吸收、代謝、保留和分佈,並且可以使用一些易感性生物標誌物(見下文)。

效應生物標誌物

影響標記可以是內源性成分,或功能能力的量度,或受暴露影響的身體或器官系統狀態或平衡的一些其他指標。 此類效應標記物通常是異常的臨床前指標。

這些生物標誌物可能是特異性的或非特異性的。 特定的生物標誌物是有用的,因為它們表明特定暴露的生物學效應,從而提供可用於預防目的的證據。 非特異性生物標誌物不指向影響的個別原因,但它們可能反映由於混合暴露引起的總體綜合影響。 因此,兩種類型的生物標誌物都可能在職業健康方面具有相當大的用途。

暴露生物標誌物和效應生物標誌物之間沒有明確的區別。 例如,可以說加合物的形成反映了一種影響而不是暴露。 然而,效應生物標誌物通常指示細胞、組織或全身功能的變化。 一些研究人員將總體變化作為影響的生物標誌物,例如暴露的實驗動物肝臟重量增加或兒童生長減慢。 出於職業健康的目的,效應生物標誌物應限於那些指示亞臨床或可逆生化變化的生物標誌物,例如酶的抑制。 最常用的效應生物標誌物可能是由某些殺蟲劑(即有機磷和氨基甲酸酯)引起的膽鹼酯酶抑制。 在大多數情況下,這種影響是完全可逆的,酶抑制反映了對這組特定殺蟲劑的總暴露。

一些暴露不會導致酶抑制,而是導致酶活性增加。 屬於 P450 家族的幾種酶就是這種情況(參見“毒性反應的遺傳決定因素”)。 它們可能是由暴露於某些溶劑和多環芳烴 (PAH) 引起的。 由於這些酶主要在難以獲得活組織檢查的組織中表達,因此在體內通過施用由該特定酶代謝的化合物間接測定酶活性,然後測量尿液或血漿中的分解產物。

其他接觸可能會誘導體內保護性蛋白質的合成。 最好的例子可能是金屬硫蛋白,它結合鎘並促進這種金屬的排泄; 鎘暴露是導致金屬硫蛋白基因表達增加的因素之一。 類似的保護性蛋白質可能存在,但尚未得到充分探索以被接受為生物標誌物。 在可能用作生物標誌物的候選者中,有所謂的應激蛋白,最初稱為熱休克蛋白。 這些蛋白質由一系列不同的生物體響應各種不利暴露而產生。

氧化損傷可以通過測定血清中丙二醛的濃度或乙烷的呼出量來評估。 同樣,尿液中小分子量蛋白質的排泄,如白蛋白,可作為早期腎損傷的生物標誌物。 臨床實踐中常規使用的幾個參數(例如,血清激素或酶水平)也可用作生物標誌物。 然而,這些參數中的許多參數可能不夠靈敏,無法檢測早期損傷。

另一組效應參數與遺傳毒性效應(染色體結構的變化)有關。 這種影響可以通過對經歷細胞分裂的白細胞進行顯微鏡檢查來檢測。 在顯微鏡下可以看到染色體的嚴重損傷——染色體畸變或微核形成。 也可以通過在細胞分裂過程中向細胞中添加染料來揭示損傷。 然後可以將暴露於基因毒劑可視化為每條染色體的兩個染色單體之間的染料交換增加(姐妹染色單體交換)。 染色體畸變與患癌症的風險增加有關,但姐妹染色單體交換率增加的意義尚不清楚。

更複雜的遺傳毒性評估是基於體細胞中的特定點突變,即從口腔粘膜獲得的白細胞或上皮細胞。 特定位點的突變可能使細胞能夠在含有其他有毒化學物質(例如 6-硫鳥嘌呤)的培養物中生長。 或者,可以評估特定基因產物(例如,由特定致癌基因編碼的致癌蛋白的血清或組織濃度)。 顯然,這些突變反映了發生的總遺傳毒性損害,並不一定表明任何有關致病暴露的信息。 這些方法尚未準備好實際用於職業健康,但這一研究領域的快速進展表明這些方法將在幾年內可用。

易感性生物標誌物

易感性標記,無論是遺傳的還是誘導的,都是個體對異生素的作用或一組此類化合物的作用特別敏感的指標。 大多數注意力都集中在遺傳易感性上,儘管其他因素可能至少同樣重要。 過敏可能是由於遺傳特徵、個體體質或環境因素造成的。

代謝某些化學物質的能力是可變的並且由基因決定(參見“毒性反應的遺傳決定因素”)。 幾種相關的酶似乎受單個基因控制。 例如,外來化學物質的氧化主要是由屬於 P450 家族的酶家族進行的。 其他酶通過結合使代謝物更易溶於水(例如,N-乙酰轉移酶和μ-穀胱甘肽-S-轉移酶)。 這些酶的活性受基因控制並且變化很大。 如上所述,可以通過給予小劑量藥物然後測定尿液中代謝物的量來測定活性。 現在已經對一些基因進行了表徵,並且可以使用技術來確定基因型。 重要研究表明,發生某些癌症形式的風險與代謝外來化合物的能力有關。 許多問題仍未得到解答,因此目前限制了這些潛在的易感性生物標誌物在職業健康中的使用。

其他遺傳特徵,例如 alpha1-抗胰蛋白酶缺乏症或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏症,也會導致體內防禦機制缺陷,從而導致對某些暴露的過敏反應。

大多數與易感性相關的研究都涉及遺傳易感性。 其他因素也發揮了作用,但部分被忽視了。 例如,患有慢性病的人可能對職業暴露更敏感。 此外,如果疾病過程或之前接觸有毒化學物質導致了一些亞臨床器官損傷,那麼承受新的有毒物質接觸的能力可能會降低。 在這種情況下,器官功能的生化指標可以用作易感性生物標誌物。 也許關於過敏的最好例子與過敏反應有關。 如果一個人對特定的接觸變得敏感,那麼可以在血清中檢測到特異性抗體。 即使個人沒有變得敏感,其他當前或過去的接觸也可能增加產生與職業接觸相關的不利影響的風險。

一個主要問題是確定工作中混合暴露的聯合效應。 此外,個人習慣和藥物使用可能導致易感性增加。 例如,煙草煙霧通常含有大量的鎘。 因此,由於職業接觸鎘,體內積累了大量這種金屬的重度吸煙者患上與鎘相關的腎臟疾病的風險會增加。

職業健康應用

生物標誌物在毒理學研究中非常有用,許多可能適用於生物監測。 儘管如此,也必須承認其局限性。 迄今為止,許多生物標誌物僅在實驗室動物中進行過研究。 其他物種的毒代動力學模式可能不一定反映人類的情況,外推可能需要對人類誌願者進行驗證性研究。 此外,必須考慮由於遺傳或體質因素導致的個體差異。

在某些情況下,暴露生物標誌物可能根本不可行(例如,對於在體內壽命短的化學品)。 其他化學物質可能儲存在或可能影響常規程序無法接觸到的器官,例如神經系統。 暴露途徑也可能影響分佈模式,因此也會影響生物標誌物的測量及其解釋。 例如,通過嗅覺神經直接暴露大腦很可能逃避暴露生物標誌物測量的檢測。 至於影響生物標誌物,其中許多根本不是特異性的,變化可能是由多種原因引起的,包括生活方式因素。 也許特別是對於易感性生物標誌物,目前解釋必須非常謹慎,因為個體基因型的整體健康意義仍然存在許多不確定性。

在職業健康領域,理想的生物標誌物應該滿足幾個要求。 首先,樣本採集和分析必須簡單可靠。 為獲得最佳分析質量,需要標準化,但具體要求差異很大。 主要關注領域包括:個體準備、採樣程序和样品處理以及測量程序; 後者包括技術因素,例如校準和質量保證程序,以及與個人相關的因素,例如操作員的教育和培訓。

對於分析有效性和可追溯性的文件,參考材料應基於相關基質,並含有適當濃度的有毒物質或適當水平的相關代謝物。 對於用於生物監測或診斷目的的生物標誌物,負責的實驗室必須有詳細記錄的分析程序和明確的性能特徵,以及可訪問的記錄以驗證結果。 儘管如此,與此同時,必須考慮表徵和使用參考材料來補充一般質量保證程序的經濟性。 因此,可實現的結果質量及其用途必須與質量保證的額外成本(包括參考材料、人力和儀器)相平衡。

另一個要求是生物標誌物應該是特定的,至少在研究的情況下,對於特定類型的暴露,與暴露程度有明確的關係。 否則,生物標誌物測量的結果可能很難解釋。 為了正確解釋暴露生物標誌物的測量結果,必須知道診斷有效性(即,將生物標誌物值轉化為可能的健康風險的大小)。 在這一領域,金屬作為生物標誌物研究的範例。 最近的研究證明了劑量反應關係的複雜性和微妙性,很難確定無影響水平,因此也很難確定可耐受的暴露量。 然而,這種研究也說明了發現相關信息所必需的調查類型和細化。 對於大多數有機化合物,暴露與相應的不良健康影響之間的定量關聯尚不可用; 在許多情況下,甚至連主要靶器官都不確定。 此外,毒性數據和生物標誌物濃度的評估通常因接觸物質混合物而變得複雜,而不是同時接觸單一化合物。

在將生物標誌物用於職業健康目的之前,需要考慮一些額外的因素。 首先,生物標誌物必須僅反映亞臨床和可逆變化。 其次,鑑於生物標誌物的結果可以解釋為健康風險,那麼預防措施應該是可用的,並且在生物標誌物數據表明需要減少暴露的情況下應該被認為是現實的。 第三,生物標誌物的實際使用必須被普遍認為是倫理上可接受的。

可以將工業衛生測量值與適用的暴露限值進行比較。 同樣,可以將暴露生物標誌物或效應生物標誌物的結果與生物作用限值(有時稱為生物暴露指數)進行比較。 此類限制應基於來自適當學科的臨床醫生和科學家的最佳建議,而作為“風險管理者”的負責任的管理者則應考慮相關的倫理、社會、文化和經濟因素。 如果可能,科學依據應包括劑量反應關係,並輔之以風險人群中易感性變化的信息。 在一些國家,工作人員和公眾成員參與標準制定過程並提供重要的投入,尤其是在科學不確定性很大的情況下。 主要的不確定性之一是如何定義應該預防的不良健康影響——例如,作為暴露生物標誌物的加合物形成本身是否代表應該預防的不良影響(即效應生物標誌物)。 在決定是否在倫理上站得住腳時,可能會出現一些難題,對於同一化合物,一方面對偶然暴露有不同的限制,另一方面對職業暴露有不同的限制。

通過使用生物標誌物產生的信息通常應傳達給在醫患關係中接受檢查的個人。 必須特別考慮與目前無法根據實際健康風險進行詳細解釋的高度實驗性生物標誌物分析相關的倫理問題。 例如,對於一般人群,目前對除血鉛濃度以外的暴露生物標誌物的解釋存在有限的指導。 同樣重要的是對生成的數據的信心(即是否進行了適當的採樣,以及是否在相關實驗室中使用了健全的質量保證程序)。 另一個特別令人擔憂的領域與個人過敏有關。 在提供研究反饋時必須考慮這些問題。

受生物標誌物研究影響或與開展生物標誌物研究有關的所有社會部門都需要參與有關如何處理研究產生的信息的決策過程。 應在該地區或國家的法律和社會框架內製定防止或克服不可避免的道德衝突的具體程序。 然而,每種情況都代表一組不同的問題和陷阱,並且無法開發出單一的公眾參與程序來涵蓋暴露生物標誌物的所有應用。

 

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遺傳毒性評估

遺傳毒性評估是評估藥物在遺傳物質 (DNA) 中誘導三種一般類型變化(突變)中任何一種的能力:基因、染色體和基因組。 在人類等生物體中,基因由 DNA 組成,DNA 由稱為核苷酸鹼基的單個單元組成。 這些基因排列在稱為染色體的離散物理結構中。 遺傳毒性會對人類健康造成重大且不可逆轉的影響。 基因毒性損傷是誘發癌症的關鍵步驟,也可能與誘發出生缺陷和胎兒死亡有關。 上述三類突變可以發生在生物體(例如人類)所擁有的兩種組織中的任何一種中:精子或卵子(生殖細胞)和剩餘組織(體細胞)。

測量基因突變的分析是檢測基因內核苷酸的​​取代、添加或缺失的分析。 測量染色體突變的分析是檢測涉及一條或多條染色體的斷裂或染色體重排的分析。 測量基因組突變的分析是檢測染色體數量變化的分析,這種情況稱為非整倍性。 自 Herman Muller 於 1927 年開發出第一個檢測基因毒性(誘變)試劑的測定方法以來,遺傳毒性評估發生了很大變化。 從那時起,已經開發了 200 多種檢測 DNA 突變的方法; 然而,如今用於遺傳毒性評估的檢測方法不到十種。 本文回顧了這些測定,描述了它們測量的內容,並探討了這些測定在毒性評估中的作用。

開發前的癌症危害識別 遺傳毒理學領域

遺傳毒理學已成為整體風險評估過程中不可或缺的一部分,並且近年來作為致癌活動的可靠預測指標而聲名鵲起。 然而,在遺傳毒理學發展之前(1970 年之前),其他方法已經並且仍在用於識別對人類的潛在癌症危害。 目前用於識別人類癌症風險的方法主要有六大類:流行病學研究、長期體內生物測定、中期體內生物測定、短期體內和體外生物測定、人工智能(構效)、和基於機制的推理。

表 1 給出了這些方法的優點和缺點。

表 1. 當前識別人類癌症風險的方法的優缺點

  優點 弊端
流行病學研究 (1) 人類是疾病的最終指標;
(2) 評估敏感或易感人群;
(3) 職業暴露隊列; (4)環境哨兵警報
(1) 一般具有追溯性(死亡證明、回憶偏差等); (2) 不敏感、成本高、冗長; (3) 有時無法獲得或難以獲得可靠的暴露數據; (四)組合、多重、複合暴露; 缺乏適當的對照組; (4) 未進行人體實驗的; (5) 癌症檢測,而非預防
長期體內生物測定 (一)前瞻性和回顧性(驗證)評價; (1) 與已確定的人類致癌物具有極好的相關性; (2) 已知的暴露水平和條件; (3) 確定化學毒性和致癌作用; (五)取得成果較快; (4) 化學類別之間的定性比較; (5) 與人類密切相關的綜合互動生物系統 (1) 很少被複製,資源密集型; (三)適合進行此類實驗的設施有限; (3)物種外推辯論; (4) 所使用的暴露水平通常遠遠超過人類所經歷的水平; (5) 單一化學品接觸並不模仿人類接觸,通常是同時接觸多種化學品
中短期體內和體外生物測定 (1) 比其他檢測更快速、更便宜; (2) 易於復制的大樣本;
(3) 測量有生物學意義的終點(突變等); (4) 可用作篩選試驗以選擇用於長期生物測定的化學品
(1) 體外不能完全預測體內; (2) 通常是生物體或器官特異性的; (3) 效力無法與整個動物或人類相比
化學結構-生物活性關聯 (1) 相對容易、快速且便宜; (2) 對某些化學類別(例如亞硝胺和聯苯胺染料)可靠; (3) 從生物學數據發展而來,但不依賴於額外的生物學實驗 (1) 不是“生物的”; (2) 制定規則的許多例外情況; (3) 回顧性的,很少(但正在成為)前瞻性的
基於機制的推斷 (1) 對某些類別的化學品而言相當準確; (2) 允許改進假設; (3) 可以將風險評估定向到敏感人群 (1) 化學致癌機制不明確、多種且可能是化學或類別特異性的; (2) 可能無法突出一般機制的例外情況

 

遺傳毒理學分析的基本原理和概念基礎

儘管用於遺傳毒性評估的測定的確切類型和數量在不斷發展並且因國家/地區而異,但最常見的包括 (1) 細菌和/或培養的哺乳動物細胞中的基因突變和 (2) 染色體突變的測定在活小鼠體內培養的哺乳動物細胞和/或骨髓。 第二類中的一些分析也可以檢測非整倍性。 儘管這些檢測無法檢測生殖細胞中的突變,但之所以使用它們,主要是因為進行生殖細胞檢測的額外成本和復雜性。 儘管如此,當需要有關生殖細胞效應的信息時,還是會使用小鼠生殖細胞試驗。

超過 25 年期間(1970-1995)的系統研究,特別是在北卡羅來納州的美國國家毒理學計劃,已經導致使用離散數量的測定來檢測試劑的誘變活性。 評估測定有用性的基本原理是基於它們檢測在囓齒動物中引起癌症和懷疑在人類中引起癌症的物質(即致癌物)的能力。 這是因為過去幾十年的研究表明,癌細胞含有某些基因的突變,而且許多致癌物也是誘變劑。 因此,癌細胞被視為含有體細胞突變,致癌作用被視為一種體細胞突變。

之所以選擇當今最常用的遺傳毒性檢測方法,不僅是因為它們的數據庫龐大、成本相對較低且易於操作,而且還因為它們已被證明可以檢測許多囓齒動物和推測的人類致​​癌物。 因此,遺傳毒性測定可用於預測藥物的潛在致癌性。

遺傳毒理學領域的一個重要概念和實踐發展是認識到許多致癌物在體內被酶修飾,產生改變的形式(代謝物),這些形式通常是母體化學物質的最終致癌和致突變形式。 為了在培養皿中復制這種新陳代謝,Heinrich Malling 表明,從囓齒動物肝臟中提取的製劑中含有許多進行這種新陳代謝轉化或激活所必需的酶。 因此,許多在培養皿或試管(體外)中進行的遺傳毒性測定都採用添加類似的酶製劑。 簡單的製劑稱為 S9 混合物,純化的製劑稱為微粒體。 一些細菌和哺乳動物細胞現已經過基因工程改造,以包含一些來自囓齒動物或人類的產生這些酶的基因,從而減少了添加 S9 混合物或微粒體的需要。

遺傳毒理學分析和技術

用於遺傳毒性篩選的主要細菌系統是沙門氏菌 (Ames) 致突變性測定,在較小程度上,菌株 WP2 大腸埃希氏菌. 1980 年代中期的研究表明,僅使用沙門氏菌系統的兩種菌株(TA98 和 TA100)就足以檢測大約 90% 的已知沙門氏菌誘變劑。 因此,這兩種菌株用於大多數篩選目的; 然而,其他各種菌株可用於更廣泛的測試。

這些化驗以多種方式進行,但兩種通用程序是板摻入和液體懸浮液化驗。 在平板摻入測定中,將細胞、測試化學品和(如果需要)S9 一起添加到液化瓊脂中,然後倒在瓊脂培養皿的表面上。 頂部瓊脂在幾分鐘內變硬,培養板孵育兩到三天,之後突變細胞生長形成肉眼可檢測的細胞簇,稱為菌落,然後對其進行計數。 瓊脂培養基含有選擇劑或由只有新突變細胞才能生長的成分組成。 液體孵育試驗類似,只是將細胞、測試劑和 S9 在不含液化瓊脂的液體中一起孵育,然後將細胞從測試劑和 S9 中去除並接種到瓊脂上。

培養的哺乳動物細胞中的突變主要在以下兩個基因之一中檢測到: 高鐵tk. 與細菌檢測類似,哺乳動物細胞系(從囓齒動物或人類細胞發育而來)在塑料培養皿或試管中暴露於測試劑,然後被接種到含有僅允許突變細胞生長的選擇劑的培養基的培養皿中. 用於此目的的檢測包括 CHO/HPRT、TK6 和小鼠淋巴瘤 L5178Y/TK+ / - 化驗。 其他包含各種 DNA 修復突變以及一些參與新陳代謝的人類基因的細胞係也被使用。 這些系統允許恢復基因內的突變(基因突變)以及涉及基因側翼染色體區域的突變(染色體突變)。 然而,後一種類型的突變在更大程度上被 tk 基因係統比 高鐵 由於基因係統的位置 tk 基因。

類似於細菌致突變性的液體孵育測定,哺乳動物細胞致突變性測定通常涉及在存在測試劑和 S9 的情況下將細胞暴露在培養皿或試管中數小時。 然後清洗細胞,再培養幾天,讓正常(野生型)基因產物被降解,新的突變基因產物得以表達和積累,然後將它們接種到含有選擇劑的培養基中,該選擇劑允許只有突變細胞才能生長。 與細菌檢測一樣,突變細胞長成肉眼可檢測的菌落,然後進行計數。

染色體突變主要通過細胞遺傳學分析來識別,其中包括將培養皿中的囓齒動物和/或囓齒動物或人類細胞暴露於測試化學品,允許發生一個或多個細胞分裂,染色染色體,然後通過顯微鏡目視檢查染色體檢測染色體結構或數量的改變。 儘管可以檢查各種終點,但監管機構目前認為最有意義的兩個終點是染色體畸變和稱為微核的子類別。

需要大量的培訓和專業知識才能對細胞中是否存在染色體畸變進行評分,這使得該過程在時間和金錢方面都非常昂貴。 相比之下,微核幾乎不需要培訓,並且可以自動檢測。 微核在細胞內顯示為與包含染色體的細胞核不同的小點。 微核是由染色體斷裂或非整倍體引起的。 由於與染色體畸變相比,微核評分更容易,而且最近的研究表明,在活小鼠骨髓中誘導染色體畸變的藥物通常會在該組織中誘導微核,因此微核現在通常被測量為一種能力的指標。誘導染色體突變的試劑。

儘管與上述其他檢測相比,生殖細胞檢測的使用頻率要低得多,但它們對於確定一種藥物是否對生殖細胞構成風險是不可或缺的,其中的突變可能會對後代的健康產生影響。 最常用的生殖細胞檢測是在小鼠中進行的,涉及的系統檢測 (1) 染色體之間的可遺傳易位(交換)(可遺傳易位檢測),(2) 基因或涉及特定基因(可見或生化特定位點)的染色體突變化驗),和(3)影響生存能力的突變(顯性致死試驗)。 與體細胞分析一樣,生殖細胞分析的工作假設是這些分析中呈陽性的試劑被認為是潛在的人類生殖細胞誘變劑。

現狀與未來展望

最近的研究表明,只需要三條信息就可以檢測出一組 90 種囓齒動物致癌物(即,假定的人類致癌物和體細胞誘變劑)中的大約 41%。 這些包括 (1) 試劑的化學結構知識,特別是如果它包含親電子部分(參見結構-活性關係部分); (2) 沙門氏菌致突變性資料; (3) 來自囓齒類動物(小鼠和大鼠)的 90 天慢性毒性試驗的數據。 事實上,基本上所有 IARC 宣布的人類致癌物都可以僅使用沙門氏菌試驗和小鼠骨髓微核試驗檢測為誘變劑。 大多數人類致癌物對大鼠和小鼠均具有致癌性(跨物種致癌物),並且大多數跨物種致癌物在沙門氏菌中具有致突變性和/或誘導微核,這一發現進一步支持使用這些致突變性試驗檢測潛在的人類致癌物在小鼠骨髓中。

隨著 DNA 技術的進步、人類基因組計劃以及對突變在癌症中作用的認識的加深,正在開發新的遺傳毒性測定法,這些測定法可能會納入標準篩選程序。 其中包括使用轉基因細胞和囓齒動物。 轉基因係統是將來自另一個物種的基因引入細胞或生物體的系統。 例如,轉基因小鼠現在處於實驗用途,允許檢測動物任何器官或組織的突變,基於將細菌基因引入小鼠。 現在可以獲得細菌細胞,如沙門氏菌和哺乳動物細胞(包括人類細胞系),它們含有參與致癌/誘變劑代謝的基因,如 P450 基因。 對轉基因囓齒類動物或天然基因(如 高鐵,或者現在可以執行沙門氏菌中的目標基因,以便確定由化學物質引起的突變的確切性質,從而提供對化學物質作用機制的深入了解,並允許與假定暴露於該物質的人類的突變進行比較.

細胞遺傳學的分子進步現在允許對染色體突變進行更詳細的評估。 這些包括使用附著(雜交)到特定基因的探針(小片段 DNA)。 染色體上基因的重排可以通過探針位置的改變來揭示,這些探針是熒光的,很容易被可視化為染色體上的彩色扇區。 用於 DNA 斷裂的單細胞凝膠電泳測定(通常稱為“彗星”測定)允許檢測單個細胞內的 DNA 斷裂,並可能成為與細胞遺傳學技術結合用於檢測染色體損傷的極其有用的工具。

經過多年的使用和系統開發的大型數據庫的生成,現在可以在短時間內(幾週)用相對較少的成本進行幾次檢測就可以完成遺傳毒性評估。 產生的數據可用於預測試劑成為囓齒動物的能力,並推測為人類致癌物/體細胞誘變劑。 這種能力可以限制誘變劑和致癌劑進入環境,並開發替代的非誘變劑。 未來的研究應該會產生比目前的檢測方法具有更高預測性的更好方法。

 

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體外毒性測試

分子和細胞生物學中尖端技術的出現刺激了包括毒理學在內的生命科學的相對快速發展。 實際上,毒理學的重點正在從整個動物和整個動物種群轉移到單個動物和人類的細胞和分子。 自 1980 世紀 XNUMX 年代中期以來,毒理學家開始採用這些新方法來評估化學品對生命系統的影響。 作為一個合乎邏輯的進展,這些方法正在適應毒性測試的目的。 這些科學進步與社會和經濟因素共同作用,影響了產品安全和潛在風險評估的變化。

經濟因素與必須測試的材料量特別相關。 每年都有大量新的化妝品、藥品、農藥、化學品和家用產品進入市場。 所有這些產品都必須評估其潛在毒性。 此外,還有大量已在使用但未經過充分測試的化學品積壓。 使用傳統的整體動物測試方法獲取所有這些化學品的詳細安全信息是一項艱鉅的任務,如果能夠完成的話,在金錢和時間方面都是昂貴的。

還有與公共健康和安全相關的社會問題,以及公眾對使用動物進行產品安全測試的日益關注。 關於人類安全,公共利益和環保倡導團體向政府機構施加了巨大壓力,要求其對化學品實施更嚴格的法規。 最近的一個例子是一些環保組織在美國禁止使用氯和含氯化合物。 這種極端行為的動機之一在於這些化合物中的大多數從未經過充分測試。 從毒理學的角度來看,僅基於氯的存在就禁止一整類不同化學品的概念在科學上是不合理的,也是不負責任的。 然而,從公眾的角度來看,必須保證釋放到環境中的化學品不會造成重大健康風險,這是可以理解的。 這種情況強調需要更有效和快速的方法來評估毒性。

影響毒性測試領域的另一個社會問題是動物福利。 世界各地越來越多的動物保護組織對使用整隻動物進行產品安全測試表示強烈反對。 為了阻止動物試驗,針對化妝品、家庭和個人護理產品以及藥品的製造商發起了積極的運動。 歐洲的此類努力促成了指令 76/768/EEC(化妝品指令)的第六次修正案的通過。 該指令的結果是,1 年 1998 月 XNUMX 日之後在動物身上測試過的化妝品或化妝品成分不能在歐盟銷售,除非替代方法未得到充分驗證。 雖然該指令對在美國或其他國家/地區銷售此類產品沒有管轄權,但它將對那些擁有包括歐洲在內的國際市場的公司產生重大影響。

替代品的概念構成了除了對整隻動物進行測試以外的測試開發的基礎,由三個定義 Rs: 減少 使用的動物數量; 精緻 協議,使動物經歷更少的壓力或不適; 和 替代 目前的動物試驗包括體外試驗(即在活體動物之外進行的試驗)、計算機模型或對低等脊椎動物或無脊椎動物進行的試驗。 他們三個 Rs 在 1959 年由兩位英國科學家 WMS Russell 和 Rex Burch 出版的一本書中進行了介紹, 人道實驗技術原理. Russell 和 Burch 堅持認為,獲得有效科學結果的唯一途徑是通過人道對待動物,並認為應該開發減少動物使用並最終取而代之的方法。 有趣的是,在 1970 世紀 XNUMX 年代中期動物福利運動重新興起之前,羅素和伯奇概述的原則很少受到關注。 今天的三個概念 Rs 在研究、測試和教育方面處於領先地位。

總之,體外測試方法的發展受到過去 20 到 XNUMX 年匯集的各種因素的影響。 很難確定這些因素中的任何一個是否會對毒性測試策略產生如此深遠的影響。

體外毒性試驗的概念

本節將僅關注用於評估毒性的體外方法,作為整體動物測試的替代方法之一。 本章其他文章中討論了計算機建模和定量構效關係等其他非動物替代方法。

體外研究通常在體外的動物或人體細胞或組織中進行。 體外的字面意思是“在玻璃中”,是指在規定條件下對在培養皿或試管中培養的活體材料或活體材料成分進行的程序。 這些可能與體內研究或“在活體動物身上”進行的研究形成對比。 當觀察僅限於培養皿中的單一類型細胞時,即使不是不可能,也很難預測化學物質對複雜生物體的影響,但體外研究確實提供了大量關於內在毒性的信息作為毒性的細胞和分子機制。 此外,與體內研究相比,它們具有許多優勢,因為它們通常更便宜並且可以在更受控的條件下進行。 此外,儘管事實上仍然需要少量動物來獲得用於體外培養的細胞,但這些方法可被視為減少替代方法(因為與體內研究相比使用的動物要少得多)和精煉替代方法(因為它們消除了需要使動物經受體內實驗造成的不良毒性後果)。

為了解釋體外毒性試驗的結果,確定它們在評估毒性方面的潛在用途並將它們與體內的整個毒理學過程聯繫起來,有必要了解正在檢查毒理學過程的哪一部分。 整個毒理學過程包括以下事件:從有機體暴露於物理或化學試劑開始,通過細胞和分子相互作用進展,並最終在整個有機體的反應中表現出來。 體外試驗通常僅限於發生在細胞和分子水平的毒理學過程的一部分。 可從體外研究中獲得的信息類型包括代謝途徑、活性代謝物與細胞和分子靶標的相互作用以及可作為暴露分子生物標誌物的潛在可測量毒性終點。 在理想情況下,每種化學物質暴露於有機體表現的毒性機制是已知的,這樣從體外試驗中獲得的信息就可以得到充分解釋,並與整個有機體的反應相關聯。 然而,這實際上是不可能的,因為已經闡明的完整毒理學機制相對較少。 因此,毒理學家面臨這樣一種情況,即體外試驗的結果不能用作對體內毒性的完全準確預測,因為機制未知。 然而,在開發體外測試的過程中,通常會闡明毒性的細胞和分子機制的組成部分。

圍繞體外測試的開發和實施的關鍵未解決問題之一與以下考慮有關:它們應該以機械為基礎,還是足以讓它們具有描述性? 從科學的角度來看,僅使用基於機械的測試來替代體內測試無疑更好。 然而,在缺乏完整的機理知識的情況下,在不久的將來開發完全替代整體動物試驗的體外試驗的前景幾乎為零。 然而,這並不排除使用更具描述性的分析類型作為早期篩查工具,目前就是這種情況。 這些屏幕導致動物使用顯著減少。 因此,在生成更多機械信息之前,可能有必要在更有限的範圍內採用其結果與體內獲得的結果完全相關的測試。

體外細胞毒性試驗

在本節中,將描述為評估化學品的細胞毒性潛力而開發的幾種體外測試。 在大多數情況下,這些測試很容易執行,並且可以自動進行分析。 一種常用的細胞毒性體外試驗是中性紅測定。 該測定是在培養細胞上進行的,對於大多數應用,細胞可以保存在包含 96 個小孔的培養皿中,每個孔的直徑為 6.4 毫米。 由於每個孔都可用於單次測定,因此這種佈置可以容納多種濃度的測試化學品以及陽性和陰性對照,每種都有足夠數量的重複。 在用至少兩個數量級(例如,從 0.01mM 到 1mM)的不同濃度的測試化學品以及陽性和陰性對照化學品處理細胞後,將細胞沖洗並用中性紅處理,只能被活細胞吸收和保留的染料。 可以在去除測試化學品時添加染料以確定即時效果,或者可以在去除測試化學品後的不同時間添加染料以確定累積或延遲效果。 每個孔中的顏色強度對應於該孔中活細胞的數量。 顏色強度通過可配備讀板器的分光光度計測量。 讀板器經過編程,可為培養皿的 96 個孔中的每個孔提供單獨的測量值。 這種自動化方法允許研究人員快速執行濃度​​響應實驗並獲得統計上有用的數據。

另一種相對簡單的細胞毒性試驗是 MTT 試驗。 MTT(3[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物)是一種四唑染料,可被線粒體酶還原成藍色。 只有具有活線粒體的細胞才能保留進行該反應的能力; 因此,顏色強度與線粒體完整性的程度直接相關。 這是檢測一般細胞毒性化合物以及那些專門針對線粒體的藥物的有用測試。

乳酸脫氫酶 (LDH) 活性的測量也用作細胞毒性的廣泛檢測。 這種酶通常存在於活細胞的細胞質中,並通過已被毒劑不利影響的死亡或垂死細胞的滲漏細胞膜釋放到細胞培養基中。 在對細胞進行化學處理後,可在不同時間去除少量培養基,以測量釋放的 LDH 量並確定毒性的時程。 雖然 LDH 釋放試驗是一種非常普遍的細胞毒性評估,但它很有用,因為它易於執行並且可以實時完成。

正在開發許多新方法來檢測細胞損傷。 更複雜的方法使用熒光探針來測量各種細胞內參數,例如鈣釋放以及 pH 和膜電位的變化。 一般來說,這些探針非常敏感,可以檢測到更細微的細胞變化,從而減少使用細胞死亡作為終點的需要。 此外,許多這些熒光測定可以通過使用 96 孔板和熒光板閱讀器實現自動化。

一旦使用這些測試之一收集了一系列化學品的數據,就可以確定相對毒性。 在體外試驗中確定的化學品的相對毒性可以表示為對未處理細胞的終點反應產生 50% 影響的濃度。 這一決定被稱為 EC50 (E有效的 C濃度為 50細胞的百分比),可用於比較不同化學品的體外毒性。 (用於評估相對毒性的類似術語是 IC50,表示導致細胞過程 50% 抑制的化學物質的濃度,例如,吸收中性紅的能力。)評估化學物質的相對體外毒性是否與其在體外的相對毒性相當並不容易體內毒性,因為體內系統中有很多混雜因素,例如毒代動力學、代謝、修復和防禦機制。 此外,由於大多數這些測定測量的是一般細胞毒性終點,因此它們不是基於機械的。 因此,體外和體內相對毒性之間的一致性是簡單相關的。 儘管從體外外推到體內存在許多複雜性和困難,但這些體外試驗被證明是非常有價值的,因為它們執行起來簡單且成本低廉,並且可以用作篩選以在早期階段標記劇毒藥物或化學品。發展。

靶器官毒性

體外試驗也可用於評估特定的靶器官毒性。 設計此類測試存在許多困難,最值得注意的是體外系統無法在體內保持器官的許多特徵。 通常,當細胞從動物身上取出並置於培養物中時,它們往往會迅速退化和/或去分化,即失去其器官樣功能並變得更加通用。 這帶來了一個問題,即在很短的時間內(通常是幾天),培養物不再可用於評估毒素的器官特異性影響。

由於分子和細胞生物學的最新進展,許多這些問題正在被克服。 獲得的關於體內細胞環境的信息可用於調節體外培養條件。 自 1980 世紀 XNUMX 年代中期以來,新的生長因子和細胞因子被發現,其中許多現已上市。 將這些因子添加到培養的細胞中有助於保持它們的完整性,也可能有助於在更長的時間內保留更多的分化功能。 其他基礎研究增加了對培養細胞的營養和激素需求的認識,因此可以配製新的培養基。 最近在識別可以在其上培養細胞的天然存在的和人工的細胞外基質方面也取得了進展。 在這些不同的基質上培養細胞會對它們的結構和功能產生深遠的影響。 從這些知識中獲得的一個主要優勢是能夠複雜地控制培養細胞的環境,並單獨檢查這些因素對基本細胞過程和它們對不同化學試劑的反應的影響。 簡而言之,這些系統可以深入了解特定器官的毒性機制。

許多靶器官毒性研究是在原代細胞中進行的,根據定義,原代細胞是從器官中新鮮分離出來的,通常在培養中的壽命有限。 使用來自器官的單一細胞類型的原代培養物進行毒性評估有很多優勢。 從機械的角度來看,這種培養物可用於研究化學物質的特定細胞靶標。 在某些情況下,可以將來自一個器官的兩種或多種細胞類型一起培養,這提供了一個額外的優勢,即能夠觀察細胞間相互作用對毒素的反應。 一些皮膚共培養系統已被設計成可以在體內形成類似於皮膚的三維結構。 也可以共培養來自不同器官(例如肝臟和腎臟)的細胞。 這種類型的培養物可用於評估必須在肝臟中生物激活的化學物質對腎細胞的特異性影響。

分子生物學工具在可用於靶器官毒性測試的連續細胞系的開發中也發揮了重要作用。 這些細胞係是通過將 DNA 轉染到原代細胞中產生的。 在轉染過程中,處理細胞和 DNA,使 DNA 可以被細胞吸收。 DNA 通常來自病毒,包含一個或多個基因,表達後可使細胞永生化(即能夠在培養物中長期存活和生長)。 還可以對 DNA 進行工程改造,使永生化基因受誘導型啟動子控制。 這種構建體的優點是細胞只有在接受適當的化學刺激以允許永生化基因表達時才會分裂。 這種構建體的一個例子是來自猿猴病毒 40 (SV40) 的大 T 抗原基因(永生化基因),其前面是金屬硫蛋白基因的啟動子區域,它是由培養基中存在的金屬誘導的。 因此,在將基因轉染到細胞中後,可以用低濃度的鋅處理細胞以刺激MT啟動子並開啟T抗原基因的表達。 在這些條件下,細胞增殖。 當從培養基中去除鋅時,細胞停止分裂並在理想條件下恢復到表達其組織特異性功能的狀態。

產生永生化細胞的能力與細胞培養技術的進步相結合,極大地促進了從許多不同器官(包括大腦、腎臟和肝臟)創建細胞系。 然而,在將這些細胞系用作真正細胞類型的替代物之前,必須仔細表徵它們以確定它們到底有多“正常”。

其他用於研究靶器官毒性的體外系統涉及越來越複雜。 隨著體外系統從單細胞培養到整個器官培養的複雜性不斷提高,它們變得與體內環境更具可比性,但與此同時,鑑於變量數量的增加,它們變得更加難以控制。 因此,在研究人員無法控制實驗環境時,可能會失去在更高級別組織中可能獲得的收益。 表 1 比較了用於研究肝毒性的各種體外系統的一些特徵。

表 1. 肝毒性研究的體外系統比較

系統 複雜
(互動水平)
保留肝臟特定功能的能力 培養的潛在持續時間 環境控制能力
永生化細胞系 一些細胞到細胞(因細胞係而異) 從差到好(因細胞係而異) 不定 優秀
原代肝細胞培養 細胞到細胞 一般到優秀(因文化條件而異) 幾天到幾週 優秀
肝細胞共培養 細胞到細胞(相同和不同細胞類型之間) 好到好 優秀
肝片 細胞到細胞(在所有細胞類型中) 好到好 數小時至數天
離體灌注肝臟 細胞間(在所有細胞類型中)和器官內 優秀 個小時裡 公平

 

精密切割的組織切片正被更廣泛地用於毒理學研究。 有可用的新儀器,使研究人員能夠在無菌環境中切割均勻的組織切片。 組織切片提供了一些優於細胞培養系統的優勢,因為器官的所有細胞類型都存在,並且它們保持其體內結構和細胞間通訊。 因此,可以進行體外研究以確定器官內的靶細胞類型以及研究特定的靶器官毒性。 切片的一個缺點是它們在培養的前 24 小時後迅速退化,這主要是由於氧氣向切片內部細胞的擴散不良。 然而,最近的研究表明,通過溫和的旋轉可以實現更有效的曝氣。 這與使用更複雜的介質一起,使切片能夠存活長達 96 小時。

組織外植體在概念上類似於組織切片,也可用於確定特定目標器官中化學物質的毒性。 組織外植體是通過取出一小塊組織(用於致畸研究,一個完整的胚胎)並將其放入培養物中進行進一步研究而建立的。 外植體培養物可用於短期毒性研究,包括皮膚刺激和腐蝕性、氣管石棉研究和腦組織神經毒性研究。

分離的灌注器官也可用於評估靶器官毒性。 這些系統提供了類似於組織切片和外植體的優勢,因為所有細胞類型都存在,但不會因製備切片的操作而對組織造成壓力。 此外,它們允許維持器官內相互作用。 一個主要的缺點是它們的短期生存能力,這限制了它們在體外毒性測試中的使用。 就作為替代品而言,這些培養物可以被認為是一種改進,因為動物不會經歷體內毒物治療的不良後果。 然而,它們的使用並沒有顯著減少所需的動物數量。

總之,有幾種類型的體外系統可用於評估靶器官毒性。 使用這些技術中的一種或多種,可以獲得有關毒性機制的大量信息。 困難仍然在於知道如何從代表毒理學過程的相對較小部分的體外系統外推到體內發生的整個過程。

眼部刺激的體外測試

從動物福利的角度來看,最具爭議的全動物毒性試驗可能是在兔子身上進行的眼睛刺激 Draize 試驗。 在這個測試中,將少量固定劑量的化學物質放入兔子的一隻眼睛中,而另一隻眼睛用作對照。 在接觸後的不同時間對刺激和炎症的程度進行評分。 正在努力開發替代該測試的方法,該測試不僅出於人道原因,而且還因為觀察的主觀性和結果的可變性而受到批評。 有趣的是,儘管 Draize 測試受到了嚴厲的批評,但它已被證明在預測人眼刺激物方面非常成功,尤其是其他方法難以識別的輕微至中度刺激性物質。 因此,對體外替代品的需求很大。

尋找 Draize 測試的替代方案是一項複雜的工作,儘管預計會成功。 已經開發了許多體外和其他替代方案,並且在某些情況下它們已經實施。 根據定義,Draize 測試的改進替代品對動物的痛苦或痛苦較小,包括 Low Volume Eye Test,其中將少量測試材料放入兔子的眼睛中,不僅出於人道原因,而且為了更接近地模擬人們實際可能意外接觸的量。 另一個改進是 pH 值小於 2 或大於 11.5 的物質不再在動物身上進行測試,因為已知它們會嚴重刺激眼睛。

1980 年至 1989 年間,用於化妝品眼部刺激性測試的兔子數量估計下降了 87%。 體外測試已被納入分層測試方法的一部分,以實現整體動物測試的大幅減少。 這種方法是一個多步驟過程,首先要全面檢查歷史眼睛刺激數據,並對要評估的化學品進行物理和化學分析。 如果這兩個過程沒有產生足夠的信息,則會進行一系列體外測試。 從體外試驗中獲得的額外數據可能足以評估物質的安全性。 如果沒有,那麼最後一步將是進行有限的體內測試。 很容易看出這種方法如何消除或至少大大減少預測測試物質安全性所需的動物數量。

用作此分級測試策略的一部分的體外測試電池取決於特定行業的需求。 從化妝品到製藥再到工業化學品,許多行業都在進行眼睛刺激測試。 每個行業所需的信息類型各不相同,因此不可能定義一個單一的體外測試電池組。 測試電池通常設計用於評估五個參數:細胞毒性、組織生理學和生物化學的變化、定量構效關係、炎症介質以及恢復和修復。 細胞毒性測試的一個例子是使用培養細胞進行的中性紅測定(見上文),這是一種可能的刺激原因。 可以在人角膜上皮細胞的培養物中測定因接觸化學品而導致的細胞生理學和生物化學變化。 或者,研究人員還使用了從屠宰場獲得的完整或解剖的牛或雞眼球。 在這些全器官培養物中測量的許多終點與體內測量的終點相同,例如角膜混濁和角膜腫脹。

炎症通常是化學性眼損傷的一個組成部分,並且有許多檢測方法可用於檢查此參數。 各種生化測定檢測在炎症過程中釋放的介質的存在,例如花生四烯酸和細胞因子。 雞蛋的絨毛尿囊膜 (CAM) 也可用作炎症指標。 在 CAM 測定中,將 14 到 XNUMX 天的雞胚的一小塊殼移除以暴露 CAM。 然後將化學物質應用於 CAM,然後在不同時間對炎症跡象(例如血管出血)進行評分。

在體外評估最困難的體內過程之一是眼部損傷的恢復和修復。 一種新開發的儀器,矽微生理計,測量細胞外 pH 值的微小變化,可用於實時監測培養的細胞。 該分析已被證明與體內恢復相當好,並已被用作該過程的體外測試。 這是對用作 Draize 眼刺激測試替代方法的測試類型的簡要概述。 在接下來的幾年內,很可能會定義一個完整的體外測試電池系列,並且每個電池都將針對其特定用途進行驗證。

驗證

監管機構接受和實施體外測試方法的關鍵是驗證,即為特定目的確定候選測試可信度的過程。 美國和歐洲都在努力定義和協調驗證過程。 歐盟於 1993 年成立了歐洲替代方法驗證中心 (ECVAM),以協調那裡的工作並與美國組織進行互動,例如美國學術中心約翰霍普金斯動物試驗替代中心 (CAAT)和替代方法驗證機構間協調委員會 (ICCVAM),由美國國立衛生研究院、美國環境保護署、美國食品和藥物管理局以及消費品安全委員會的代表組成。

體外試驗的驗證需要大量的組織和計劃。 政府監管機構以及工業界和學術界的科學家必須就可接受的程序達成共識,並由科學顧問委員會進行充分監督,以確保協議符合既定標準。 驗證研究應在一系列參考實驗室中進行,使用來自化學庫的校準化學品組和來自單一來源的細胞或組織。 必須證明候選測試的實驗室內重複性和實驗室間再現性,並對結果進行適當的統計分析。 一旦驗證研究的不同組成部分的結果得到匯總,科學顧問委員會就可以針對特定目的對候選測試的有效性提出建議。 此外,研究結果應發表在同行評審的期刊上,並放入數據庫中。

驗證過程的定義目前正在進行中。 每項新的驗證研究都將為下一項研究的設計提供有用的信息。 國際交流與合作對於快速制定廣泛接受的一系列協議至關重要,特別是考慮到 EC 化妝品指令的通過所帶來的緊迫性。 這項立法確實可以為進行認真的驗證工作提供所需的動力。 只有完成這一過程,才能開始接受各種監管機構的體外方法。

結論

本文概述了體外毒性測試的現狀。 體外毒理學科學相對年輕,但它正在呈指數級增長。 未來幾年的挑戰是將細胞和分子研究產生的機理知識納入大量體內數據清單,以提供更完整的毒理學機制描述,並建立可以使用體外數據的範例預測體內毒性。 只有通過毒理學家和政府代表的共同努力,才能實現這些體外方法的內在價值。

 

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週日,一月16 2011:18 56

結構活動關係

結構活性關係 (SAR) 分析是利用有關化學品分子結構的信息來預測與持久性、分佈、攝取和吸收以及毒性相關的重要特性。 SAR 是一種識別潛在危險化學品的替代方法,它有望幫助行業和政府確定物質的優先順序,以便進一步評估或用於新化學品的早期決策。 毒理學是一項日益昂貴和資源密集型的工作。 人們越來越擔心化學品可能會對暴露的人群造成不利影響,這促使監管機構和衛生機構擴大測試範圍和靈敏度,以檢測毒理學危害。 與此同時,監管對行業的實際和感知負擔引起了人們對毒性測試方法和數據分析實用性的擔憂。 目前,化學致癌性的確定取決於對至少兩個物種(男女)在不同劑量下的壽命測試,對多個器官進行仔細的組織病理學分析,以及檢測細胞和靶器官的癌前變化。 在美國,癌症生物測定的成本估計超過 3 萬美元(1995 年美元)。

即使有無限的財政資源,測試當今世界生產的大約 70,000 種現有化學品的負擔也將超過訓練有素的毒理學家的可用資源。 即使是對這些化學品的一級評估也需要幾個世紀的時間才能完成 (NRC 1984)。 在許多國家,對在毒性試驗中使用動物的倫理問題有所增加,這給使用標準毒性試驗方法帶來了額外的壓力。 SAR 已廣泛用於製藥行業,以識別具有治療有益用途潛力的分子(Hansch 和 Zhang 1993)。 在環境和職業健康政策中,SAR 用於預測化合物在物理化學環境中的擴散,並篩選新化學品以進一步評估潛在毒性。 根據美國有毒物質控制法 (TSCA),EPA 自 1979 年以來一直使用 SAR 方法作為製造前通知 (PMN) 過程中新化學品的“第一篩選”; 澳大利亞使用類似的方法作為其新化學品通知 (NICNAS) 程序的一部分。 在美國,SAR 分析是確定是否有合理依據得出結論認為物質的製造、加工、分銷、使用或處置將對人類健康或環境造成不合理的傷害風險的重要依據,如第TSCA 的 5(f)。 基於這一發現,EPA 然後可以根據 TSCA 第 6 節要求對該物質進行實際測試。

搜尋與援救的理由

SAR 的科學原理基於這樣的假設,即化學物質的分子結構將預測其在物理化學和生物系統中行為的重要方面(Hansch 和 Leo 1979)。

搜救過程

SAR 審查過程包括鑑定化學結構,包括經驗配方和純化合物; 結構相似物質的鑑定; 在數據庫和文獻中搜索有關結構類似物的信息; 毒性分析和結構類似物的其他數據。 在極少數情況下,僅關於化合物結構的信息就足以支持某些基於充分理解的毒性機制的 SAR 分析。 已經編制了幾個關於 SAR 的數據庫,以及基於計算機的分子結構預測方法。

利用此信息,可以使用 SAR 估算以下端點:

  • 理化參數:沸點、蒸氣壓、水溶性、辛醇/水分配係數
  • 生物/環境歸宿參數:生物降解、土壤吸附、光降解、藥代動力學
  • 毒性參數:水生生物毒性、吸收、急性哺乳動物毒性(限度試驗或LD50)、皮膚、肺和眼睛刺激、致敏、亞慢性毒性、致突變性。

 

應該指出的是,對於致癌性、發育毒性、生殖毒性、神經毒性、免疫毒性或其他靶器官效應等重要的健康終點,不存在 SAR 方法。 這是由三個因素造成的:缺乏用於檢驗 SAR 假設的大型數據庫,缺乏對毒性作用的結構決定因素的了解,以及這些終點所涉及的靶細胞和機制的多樣性(參見“美國生殖毒物和神經毒劑的風險評估方法”)。 利用分配係數和溶解度的信息,利用 SAR 預測藥代動力學的一些有限嘗試(Johanson 和 Naslund 1988)。 已經進行了更廣泛的定量 SAR 來預測一系列化合物的 P450 依賴性代謝以及二噁英和 PCB 樣分子與細胞溶質“二噁英”受體的結合(Hansch 和 Zhang 1993)。

SAR 已被證明對上面列出的一些終點具有不同的可預測性,如表 1 所示。該表提供了預測活動與通過經驗測量或毒性測試獲得的實際結果的兩次比較的數據。 美國 EPA 專家進行的 SAR 在預測物理化學特性方面的表現比預測生物活性(包括生物降解)的表現更差。 對於毒性終點,SAR 在預測致突變性方面表現最好。 Ashby 和 Tennant (1991) 在一項更廣泛的研究中也發現,在他們對 NTP 化學品的分析中,短期遺傳毒性具有良好的可預測性。 考慮到目前對遺傳毒性分子機制(參見“遺傳毒理學”)和親電性在 DNA 結合中的作用的理解,這些發現並不令人驚訝。 相比之下,SAR 傾向於低估哺乳動物的全身和亞慢性毒性,而高估水生生物的急性毒性。

表 1. SAR 和測試數據的比較:OECD/NTP 分析

端點 協議 (%) 分歧 (%) 聯繫電話
沸點 50 50 30
蒸汽壓力 63 37 113
水溶性 68 32 133
分配係數 61 39 82
生物降解 93 7 107
魚類毒性 77 22 130
水溞毒性 67 33 127
急性哺乳動物毒性 (LD50 ) 80 201 142
皮膚過敏 82 18 144
眼睛刺激 78 22 144
皮膚過敏 84 16 144
亞慢性毒性 57 32 143
致突變性2 88 12 139
致突變性3 82-944 1-10 301
致癌性3 : 兩年生物測定 72-954 - 301

資料來源:來自經合組織的數據,個人通訊 C. Auer,美國環保署。 本分析僅使用可比較 SAR 預測和實際測試數據的那些端點。 NTP 數據來自 Ashby 和 Tennant 1991。

1 令人擔憂的是 SAR 未能預測 12% 的測試化學品的急性毒性。

2 OECD 數據,基於 Ames 測試與 SAR 的一致性

3 NTP 數據,基於基因毒性分析與幾類“結構性警報化學品”的 SAR 預測的比較。

4 一致性因班級而異; 一致性最高的是芳香氨基/硝基化合物; 最低的是“雜項”結構。

對於其他有毒終點,如上所述,SAR 的實用性較差。 由於缺乏複雜分子毒代動力學的 SAR,哺乳動物毒性預測變得複雜。 儘管如此,已經進行了一些嘗試來提出複雜哺乳動物毒性終點的 SAR 原則(例如,參見 Bernstein (1984) 對潛在雄性生殖毒物的 SAR 分析)。 在大多數情況下,數據庫太小而無法對基於結構的預測進行嚴格測試。

在這一點上可以得出結論,SAR 可能主要用於確定毒性測試資源投資的優先次序或引起對潛在危害的早期關注。 只有在致突變性的情況下,SAR 分析本身才有可能可靠地用於為其他決策提供信息。 對於任何終點,SAR 都不可能提供本章其他地方討論的風險評估目的所需的定量信息類型,並且 百科全書.

 

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