L'évaluation de la toxicité génétique est l'évaluation des agents pour leur capacité à induire l'un des trois types généraux de changements (mutations) dans le matériel génétique (ADN) : gène, chromosomique et génomique. Dans des organismes tels que les humains, les gènes sont composés d'ADN, qui se compose d'unités individuelles appelées bases nucléotidiques. Les gènes sont disposés dans des structures physiques discrètes appelées chromosomes. La génotoxicité peut entraîner des effets importants et irréversibles sur la santé humaine. Les dommages génotoxiques sont une étape critique dans l'induction du cancer et peuvent également être impliqués dans l'induction de malformations congénitales et de mort fœtale. Les trois classes de mutations mentionnées ci-dessus peuvent se produire dans l'un ou l'autre des deux types de tissus possédés par des organismes tels que les humains : les spermatozoïdes ou les ovules (cellules germinales) et le tissu restant (cellules somatiques).
Les tests qui mesurent la mutation génique sont ceux qui détectent la substitution, l'addition ou la suppression de nucléotides dans un gène. Les tests qui mesurent la mutation chromosomique sont ceux qui détectent les cassures ou les réarrangements chromosomiques impliquant un ou plusieurs chromosomes. Les tests qui mesurent la mutation génomique sont ceux qui détectent les changements dans le nombre de chromosomes, une condition appelée aneuploïdie. L'évaluation de la toxicité génétique a considérablement évolué depuis la mise au point par Herman Muller en 1927 du premier test de détection d'agents génotoxiques (mutagènes). Depuis lors, plus de 200 tests ont été développés pour mesurer les mutations de l'ADN ; cependant, moins de dix tests sont couramment utilisés aujourd'hui pour l'évaluation de la toxicité génétique. Cet article passe en revue ces essais, décrit ce qu'ils mesurent et explore le rôle de ces essais dans l'évaluation de la toxicité.
Identification des risques de cancerAvant le développement du Domaine de la toxicologie génétique
La toxicologie génétique est devenue une partie intégrante du processus global d'évaluation des risques et s'est récemment imposée comme un prédicteur fiable de l'activité cancérigène. Cependant, avant le développement de la toxicologie génétique (avant 1970), d'autres méthodes étaient et sont toujours utilisées pour identifier les risques potentiels de cancer chez l'homme. Il existe six grandes catégories de méthodes actuellement utilisées pour identifier les risques de cancer chez l'homme : les études épidémiologiques, les bioessais in vivo à long terme, les bioessais in vivo à moyen terme, les bioessais in vivo et in vitro à court terme, l'intelligence artificielle (structure-activité), et l'inférence basée sur le mécanisme.
Le tableau 1 donne les avantages et les inconvénients de ces méthodes.
Tableau 1. Avantages et inconvénients des méthodes actuelles d'identification des risques de cancer chez l'homme
| Avantages | Inconvénients | |
| Les études épidémiologiques | (1) les humains sont les indicateurs ultimes de la maladie ; (2) évaluer les populations sensibles ou sensibles ; (3) cohortes d'exposition professionnelle; (4) alertes sentinelles environnementales |
(1) généralement rétrospectif (certificats de décès, biais de rappel, etc.) ; (2) insensible, coûteux, long ; (3) des données d'exposition fiables parfois indisponibles ou difficiles à obtenir ; (4) expositions combinées, multiples et complexes; manque de cohortes de contrôle appropriées; (5) les expériences sur les humains ne sont pas faites ; (6) détection du cancer, pas prévention |
| Essais biologiques in vivo à long terme | (1) évaluations prospectives et rétrospectives (validation) ; (2) excellente corrélation avec les carcinogènes humains identifiés; (3) niveaux et conditions d'exposition connus; (4) identifie la toxicité chimique et les effets cancérigènes ; (5) des résultats obtenus assez rapidement ; (6) comparaisons qualitatives entre classes chimiques; (7) systèmes biologiques intégratifs et interactifs étroitement liés aux humains | (1) rarement reproduit, gourmand en ressources ; (3) des installations limitées adaptées à de telles expériences ; (4) débat sur l'extrapolation des espèces; (5) les expositions utilisées sont souvent à des niveaux bien supérieurs à ceux subis par les humains; (6) l'exposition à un seul produit chimique n'imite pas les expositions humaines, qui sont généralement à plusieurs produits chimiques simultanément |
| Essais biologiques in vivo et in vitro à moyen et court terme | (1) plus rapide et moins cher que les autres tests ; (2) de grands échantillons facilement reproductibles ; (3) les points limites biologiquement significatifs sont mesurés (mutation, etc.); (4) peuvent être utilisés comme essais de dépistage pour sélectionner des produits chimiques pour des essais biologiques à long terme |
(1) in vitro pas entièrement prédictif d'in vivo; (2) généralement spécifiques à un organisme ou à un organe ; (3) puissances non comparables à des animaux entiers ou à des humains |
| Associations structure chimique–activité biologique | (1) relativement facile, rapide et peu coûteux ; (2) fiable pour certaines classes chimiques (par exemple, les colorants nitrosamines et benzidine); (3) développé à partir de données biologiques mais non dépendant d'expérimentations biologiques supplémentaires | (1) non « biologique » ; (2) de nombreuses exceptions aux règles formulées; (3) rétrospective et rarement (mais devenant) prospective |
| Inférences basées sur le mécanisme | (1) raisonnablement précis pour certaines classes de produits chimiques ; (2) permet d'affiner les hypothèses ; (3) peut orienter les évaluations des risques vers les populations sensibles | (1) mécanismes de carcinogenèse chimique indéfinis, multiples et probablement chimiques ou spécifiques à une classe ; (2) peut ne pas mettre en évidence les exceptions aux mécanismes généraux |
Justification et fondement conceptuel des tests de toxicologie génétique
Bien que les types et le nombre exacts de tests utilisés pour l'évaluation de la toxicité génétique évoluent constamment et varient d'un pays à l'autre, les plus courants incluent des tests pour (1) la mutation génique dans les bactéries et/ou les cellules de mammifères cultivées et (2) la mutation chromosomique dans des cellules de mammifères cultivées et/ou de la moelle osseuse chez des souris vivantes. Certains des tests de cette deuxième catégorie peuvent également détecter l'aneuploïdie. Bien que ces tests ne détectent pas les mutations dans les cellules germinales, ils sont principalement utilisés en raison du coût supplémentaire et de la complexité de la réalisation des tests sur les cellules germinales. Néanmoins, les tests sur les cellules germinales chez la souris sont utilisés lorsque des informations sur les effets sur les cellules germinales sont souhaitées.
Des études systématiques sur une période de 25 ans (1970-1995), en particulier au US National Toxicology Program en Caroline du Nord, ont abouti à l'utilisation d'un nombre discret de tests pour détecter l'activité mutagène des agents. La raison d'être de l'évaluation de l'utilité des tests reposait sur leur capacité à détecter des agents qui causent le cancer chez les rongeurs et qui sont soupçonnés de causer le cancer chez l'homme (c.-à-d., des agents cancérigènes). En effet, des études menées au cours des dernières décennies ont indiqué que les cellules cancéreuses contiennent des mutations dans certains gènes et que de nombreux agents cancérigènes sont également mutagènes. Ainsi, les cellules cancéreuses sont considérées comme contenant des mutations des cellules somatiques et la carcinogenèse est considérée comme un type de mutagenèse des cellules somatiques.
Les tests de toxicité génétique les plus couramment utilisés aujourd'hui ont été sélectionnés non seulement en raison de leur grande base de données, de leur coût relativement faible et de leur facilité d'exécution, mais aussi parce qu'il a été démontré qu'ils détectent de nombreux cancérogènes chez les rongeurs et, par présomption, chez l'homme. Par conséquent, des tests de toxicité génétique sont utilisés pour prédire la cancérogénicité potentielle des agents.
Un développement conceptuel et pratique important dans le domaine de la toxicologie génétique a été la reconnaissance que de nombreux cancérogènes étaient modifiés par des enzymes dans le corps, créant des formes altérées (métabolites) qui étaient souvent la forme cancérigène et mutagène ultime de la substance chimique mère. Pour dupliquer ce métabolisme dans une boîte de Pétri, Heinrich Malling a montré que l'inclusion d'une préparation de foie de rongeur contenait de nombreuses enzymes nécessaires pour effectuer cette conversion ou activation métabolique. Ainsi, de nombreux tests de toxicité génétique effectués dans des boîtes ou des tubes (in vitro) emploient l'addition de préparations enzymatiques similaires. Les préparations simples sont appelées mélange S9 et les préparations purifiées sont appelées microsomes. Certaines cellules bactériennes et mammifères ont maintenant été génétiquement modifiées pour contenir certains des gènes de rongeurs ou d'humains qui produisent ces enzymes, réduisant ainsi la nécessité d'ajouter un mélange S9 ou des microsomes.
Dosages et techniques de toxicologie génétique
Les principaux systèmes bactériens utilisés pour le dépistage de la toxicité génétique sont le test de mutagénicité de Salmonella (Ames) et, dans une bien moindre mesure, la souche WP2 de Escherichia coli. Des études menées au milieu des années 1980 ont indiqué que l'utilisation de seulement deux souches du système Salmonella (TA98 et TA100) était suffisante pour détecter environ 90 % des mutagènes connus de Salmonella. Ainsi, ces deux souches sont utilisées pour la plupart des objectifs de dépistage ; cependant, diverses autres souches sont disponibles pour des tests plus approfondis.
Ces dosages sont effectués de diverses manières, mais deux procédures générales sont les dosages d'incorporation sur plaque et de suspension liquide. Dans le test d'incorporation sur plaque, les cellules, le produit chimique d'essai et (le cas échéant) le S9 sont ajoutés ensemble dans une gélose liquéfiée et versés sur la surface d'une boîte de Pétri d'agar. La gélose supérieure durcit en quelques minutes et les plaques sont incubées pendant deux à trois jours, après quoi les cellules mutantes se sont développées pour former des amas de cellules détectables visuellement appelées colonies, qui sont ensuite comptées. Le milieu gélosé contient des agents sélectifs ou est composé d'ingrédients tels que seules les cellules nouvellement mutées se développeront. Le test d'incubation liquide est similaire, sauf que les cellules, l'agent de test et S9 sont incubés ensemble dans un liquide qui ne contient pas d'agar liquéfié, puis les cellules sont lavées sans l'agent de test et S9 et ensemencées sur l'agar.
Les mutations dans les cellules de mammifères en culture sont principalement détectées dans l'un des deux gènes suivants : hprt ainsi que tk. Comme pour les tests bactériens, les lignées cellulaires de mammifères (développées à partir de cellules de rongeurs ou humaines) sont exposées à l'agent de test dans des boîtes ou des tubes de culture en plastique, puis sont ensemencées dans des boîtes de culture contenant un milieu avec un agent sélectif qui permet uniquement aux cellules mutantes de se développer. . Les tests utilisés à cette fin comprennent le CHO/HPRT, le TK6 et le lymphome de souris L5178Y/TK+/- dosages. D'autres lignées cellulaires contenant diverses mutations de réparation de l'ADN ainsi que certains gènes humains impliqués dans le métabolisme sont également utilisées. Ces systèmes permettent la récupération de mutations au sein du gène (mutation génique) ainsi que de mutations impliquant des régions du chromosome flanquant le gène (mutation chromosomique). Cependant, ce dernier type de mutation est beaucoup plus récupéré par la tk systèmes de gènes que par le hprt systèmes de gènes en raison de l'emplacement du tk .
Semblable au test d'incubation liquide pour la mutagénicité bactérienne, les tests de mutagénicité sur les cellules de mammifères impliquent généralement l'exposition des cellules dans des boîtes ou des tubes de culture en présence de l'agent de test et de S9 pendant plusieurs heures. Les cellules sont ensuite lavées, cultivées pendant plusieurs jours supplémentaires pour permettre la dégradation des produits géniques normaux (de type sauvage) et l'expression et l'accumulation des produits géniques nouvellement mutants, puis elles sont ensemencées dans un milieu contenant un agent sélectif qui permet seules les cellules mutantes se développent. Comme les tests bactériens, les cellules mutantes se développent en colonies visuellement détectables qui sont ensuite comptées.
La mutation chromosomique est identifiée principalement par des tests cytogénétiques, qui impliquent d'exposer des rongeurs et/ou des cellules de rongeurs ou humaines dans des boîtes de culture à un produit chimique d'essai, permettant à une ou plusieurs divisions cellulaires de se produire, de colorer les chromosomes, puis d'examiner visuellement les chromosomes au microscope. détecter des altérations de la structure ou du nombre de chromosomes. Bien qu'une variété de paramètres puissent être examinés, les deux qui sont actuellement acceptés par les organismes de réglementation comme étant les plus significatifs sont les aberrations chromosomiques et une sous-catégorie appelée micronoyaux.
Une formation et une expertise considérables sont nécessaires pour évaluer la présence d'aberrations chromosomiques dans les cellules, ce qui en fait une procédure coûteuse en temps et en argent. En revanche, les micronoyaux nécessitent peu de formation et leur détection peut être automatisée. Les micronoyaux apparaissent sous forme de petits points dans la cellule qui sont distincts du noyau, qui contient les chromosomes. Les micronoyaux résultent soit d'une rupture chromosomique, soit d'une aneuploïdie. En raison de la facilité de notation des micronoyaux par rapport aux aberrations chromosomiques, et parce que des études récentes indiquent que les agents qui induisent des aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse des souris vivantes induisent généralement des micronoyaux dans ce tissu, les micronoyaux sont maintenant couramment mesurés comme une indication de la capacité d'un agent pour induire la mutation chromosomique.
Bien que les tests sur les cellules germinales soient utilisés beaucoup moins fréquemment que les autres tests décrits ci-dessus, ils sont indispensables pour déterminer si un agent présente un risque pour les cellules germinales, dont les mutations peuvent entraîner des effets sur la santé des générations suivantes. Les tests de cellules germinales les plus couramment utilisés sont chez la souris et impliquent des systèmes qui détectent (1) les translocations héréditaires (échanges) entre les chromosomes (test de translocation héréditaire), (2) les mutations génétiques ou chromosomiques impliquant des gènes spécifiques (locus visible ou biochimique spécifique). tests) et (3) les mutations qui affectent la viabilité (dosage létal dominant). Comme pour les tests sur les cellules somatiques, l'hypothèse de travail avec les tests sur les cellules germinales est que les agents positifs dans ces tests sont présumés être des mutagènes potentiels des cellules germinales humaines.
Situation actuelle et perspectives d'avenir
Des études récentes ont indiqué que seulement trois éléments d'information étaient nécessaires pour détecter environ 90 % d'un ensemble de 41 cancérogènes chez les rongeurs (c.-à-d., cancérogènes humains présumés et mutagènes des cellules somatiques). Celles-ci comprenaient (1) la connaissance de la structure chimique de l'agent, en particulier s'il contient des fractions électrophiles (voir la section sur les relations structure-activité) ; (2) Données sur la mutagénicité de Salmonella ; et (3) les données d'un test de toxicité chronique de 90 jours chez les rongeurs (souris et rats). En effet, pratiquement tous les cancérogènes humains déclarés par le CIRC sont détectables en tant que mutagènes en utilisant uniquement le test Salmonella et le test du micronoyau de moelle osseuse de souris. L'utilisation de ces essais de mutagénicité pour détecter des cancérogènes humains potentiels est étayée par la découverte que la plupart des cancérogènes pour l'homme sont cancérigènes à la fois pour les rats et les souris (cancérigènes trans-espèces) et que la plupart des cancérogènes trans-espèces sont mutagènes pour Salmonella et/ou induisent des micronoyaux. dans la moelle osseuse de souris.
Avec les progrès de la technologie de l'ADN, le projet du génome humain et une meilleure compréhension du rôle de la mutation dans le cancer, de nouveaux tests de génotoxicité sont en cours de développement et seront probablement intégrés aux procédures de dépistage standard. Parmi ceux-ci figurent l'utilisation de cellules transgéniques et de rongeurs. Les systèmes transgéniques sont ceux dans lesquels un gène d'une autre espèce a été introduit dans une cellule ou un organisme. Par exemple, des souris transgéniques sont maintenant utilisées à titre expérimental pour permettre la détection d'une mutation dans n'importe quel organe ou tissu de l'animal, sur la base de l'introduction d'un gène bactérien dans la souris. Des cellules bactériennes, telles que Salmonella, et des cellules de mammifères (y compris des lignées cellulaires humaines) sont désormais disponibles et contiennent des gènes impliqués dans le métabolisme d'agents cancérigènes/mutagènes, tels que les gènes P450. L'analyse moléculaire des mutations réelles induites dans le trans-gène chez les rongeurs transgéniques, ou dans les gènes natifs tels que hprt, ou les gènes cibles au sein de Salmonella peuvent maintenant être analysés, de sorte que la nature exacte des mutations induites par les produits chimiques puisse être déterminée, fournissant des informations sur le mécanisme d'action du produit chimique et permettant des comparaisons avec des mutations chez des humains présumés exposés à l'agent .
Les progrès moléculaires de la cytogénétique permettent maintenant une évaluation plus détaillée des mutations chromosomiques. Celles-ci incluent l'utilisation de sondes (petits morceaux d'ADN) qui se fixent (s'hybrident) à des gènes spécifiques. Des réarrangements de gènes sur le chromosome peuvent alors être révélés par la localisation altérée des sondes, qui sont fluorescentes et facilement visualisables sous forme de secteurs colorés sur les chromosomes. Le test d'électrophorèse sur gel unicellulaire pour la rupture de l'ADN (communément appelé le test «comète») permet la détection des ruptures d'ADN dans des cellules individuelles et peut devenir un outil extrêmement utile en combinaison avec des techniques cytogénétiques pour détecter les dommages chromosomiques.
Après de nombreuses années d'utilisation et la génération d'une base de données importante et systématiquement développée, l'évaluation de la toxicité génétique peut désormais être effectuée avec seulement quelques tests pour un coût relativement faible dans un court laps de temps (quelques semaines). Les données produites peuvent être utilisées pour prédire la capacité d'un agent à être un rongeur et, par présomption, un cancérigène humain/mutagène des cellules somatiques. Une telle capacité permet de limiter l'introduction dans l'environnement d'agents mutagènes et cancérigènes et de développer des agents alternatifs non mutagènes. Les études futures devraient conduire à des méthodes encore meilleures avec une plus grande prédictivité que les tests actuels.