L'emergere di sofisticate tecnologie nella biologia molecolare e cellulare ha stimolato un'evoluzione relativamente rapida nelle scienze della vita, compresa la tossicologia. In effetti, l'attenzione della tossicologia si sta spostando da interi animali e popolazioni di interi animali alle cellule e alle molecole di singoli animali e umani. Dalla metà degli anni '1980, i tossicologi hanno iniziato a impiegare queste nuove metodologie per valutare gli effetti delle sostanze chimiche sui sistemi viventi. Come logica progressione, tali metodi vengono adattati ai fini dei test di tossicità. Questi progressi scientifici hanno collaborato con fattori sociali ed economici per modificare la valutazione della sicurezza del prodotto e del rischio potenziale.

I fattori economici sono specificamente legati al volume dei materiali che devono essere testati. Ogni anno viene introdotta sul mercato una miriade di nuovi cosmetici, prodotti farmaceutici, pesticidi, prodotti chimici e prodotti per la casa. Tutti questi prodotti devono essere valutati per la loro potenziale tossicità. Inoltre, vi è un arretrato di prodotti chimici già in uso che non sono stati adeguatamente testati. L'enorme compito di ottenere informazioni dettagliate sulla sicurezza di tutte queste sostanze chimiche utilizzando i tradizionali metodi di sperimentazione su animali interi sarebbe costoso in termini sia di denaro che di tempo, se potesse essere portato a termine.

Esistono anche questioni sociali che riguardano la salute e la sicurezza pubblica, nonché una crescente preoccupazione del pubblico sull'uso di animali per i test sulla sicurezza dei prodotti. Per quanto riguarda la sicurezza umana, l'interesse pubblico e i gruppi di difesa dell'ambiente hanno esercitato pressioni significative sulle agenzie governative affinché applicassero normative più rigorose sulle sostanze chimiche. Un recente esempio di ciò è stato un movimento di alcuni gruppi ambientalisti per vietare il cloro e i composti contenenti cloro negli Stati Uniti. Una delle motivazioni di un'azione così estrema risiede nel fatto che la maggior parte di questi composti non è mai stata adeguatamente testata. Dal punto di vista tossicologico, il concetto di vietare un'intera classe di sostanze chimiche diverse basato semplicemente sulla presenza di cloro è sia scientificamente infondato che irresponsabile. Tuttavia, è comprensibile che, dal punto di vista del pubblico, ci debba essere una certa garanzia che le sostanze chimiche rilasciate nell'ambiente non comportino un rischio significativo per la salute. Tale situazione sottolinea la necessità di metodi più efficienti e rapidi per valutare la tossicità.

L'altra preoccupazione della società che ha avuto un impatto sull'area dei test di tossicità è il benessere degli animali. Il numero crescente di gruppi per la protezione degli animali in tutto il mondo ha espresso una notevole opposizione all'uso di animali interi per i test sulla sicurezza dei prodotti. Sono state condotte campagne attive contro i produttori di cosmetici, prodotti per la cura della casa e della persona e prodotti farmaceutici nel tentativo di fermare i test sugli animali. Tali sforzi in Europa hanno portato all'approvazione del sesto emendamento alla direttiva 76/768/CEE (la direttiva sui cosmetici). La conseguenza di questa direttiva è che i prodotti cosmetici o gli ingredienti cosmetici che sono stati testati sugli animali dopo il 1° gennaio 1998 non possono essere commercializzati nell'Unione Europea, a meno che metodi alternativi non siano sufficientemente convalidati. Sebbene questa direttiva non abbia giurisdizione sulla vendita di tali prodotti negli Stati Uniti o in altri paesi, influirà in modo significativo sulle società che hanno mercati internazionali che includono l'Europa.

Il concetto di alternative, che costituisce la base per lo sviluppo di test diversi da quelli su animali interi, è definito dai tre Rs: riduzione nel numero di animali utilizzati; raffinatezza di protocolli in modo che gli animali provino meno stress o disagio; e sostituzione degli attuali test sugli animali con test in vitro (cioè test eseguiti al di fuori dell'animale vivente), modelli computerizzati o test su specie di vertebrati o invertebrati inferiori. I tre Rs sono stati introdotti in un libro pubblicato nel 1959 da due scienziati britannici, WMS Russell e Rex Burch, I principi della tecnica sperimentale umana. Russell e Burch sostenevano che l'unico modo per ottenere risultati scientifici validi fosse attraverso il trattamento umano degli animali e ritenevano che si dovessero sviluppare metodi per ridurre l'uso di animali e alla fine sostituirlo. È interessante notare che i principi delineati da Russell e Burch hanno ricevuto poca attenzione fino alla rinascita del movimento per il benessere degli animali a metà degli anni '1970. Oggi il concetto dei tre Rs è all'avanguardia per quanto riguarda la ricerca, i test e l'istruzione.

In sintesi, lo sviluppo delle metodologie di test in vitro è stato influenzato da una varietà di fattori che sono confluiti negli ultimi dieci o vent'anni. È difficile accertare se qualcuno di questi fattori da solo avrebbe avuto un effetto così profondo sulle strategie dei test di tossicità.

Concetto di test di tossicità in vitro

Questa sezione si concentrerà esclusivamente sui metodi in vitro per valutare la tossicità, come una delle alternative alla sperimentazione su animali interi. Ulteriori alternative non animali come la modellazione al computer e le relazioni quantitative struttura-attività sono discusse in altri articoli di questo capitolo.

Gli studi in vitro sono generalmente condotti su cellule o tessuti animali o umani al di fuori del corpo. In vitro significa letteralmente "in vetro" e si riferisce a procedure eseguite su materiale vivo o componenti di materiale vivo coltivate in capsule di Petri o in provette in condizioni definite. Questi possono essere messi a confronto con gli studi in vivo, o con quelli effettuati “nell'animale vivente”. Sebbene sia difficile, se non impossibile, proiettare gli effetti di una sostanza chimica su un organismo complesso quando le osservazioni sono limitate a un singolo tipo di cellule in una piastra, gli studi in vitro forniscono anche una quantità significativa di informazioni sulla tossicità intrinseca. come meccanismi cellulari e molecolari di tossicità. Inoltre, offrono molti vantaggi rispetto agli studi in vivo in quanto sono generalmente meno costosi e possono essere condotti in condizioni più controllate. Inoltre, nonostante il fatto che sia ancora necessario un piccolo numero di animali per ottenere cellule per colture in vitro, questi metodi possono essere considerati alternative di riduzione (poiché vengono utilizzati molti meno animali rispetto agli studi in vivo) e alternative di raffinamento (perché eliminano la necessità sottoporre gli animali alle conseguenze tossiche avverse imposte dagli esperimenti in vivo).

Per interpretare i risultati dei test di tossicità in vitro, determinarne la potenziale utilità nella valutazione della tossicità e metterli in relazione con il processo tossicologico complessivo in vivo, è necessario comprendere quale parte del processo tossicologico si sta esaminando. L'intero processo tossicologico è costituito da eventi che iniziano con l'esposizione dell'organismo a un agente fisico o chimico, progrediscono attraverso interazioni cellulari e molecolari e si manifestano infine nella risposta dell'intero organismo. I test in vitro sono generalmente limitati alla parte del processo tossicologico che avviene a livello cellulare e molecolare. I tipi di informazioni che possono essere ottenuti dagli studi in vitro includono le vie del metabolismo, l'interazione dei metaboliti attivi con i bersagli cellulari e molecolari e gli endpoint tossici potenzialmente misurabili che possono fungere da biomarcatori molecolari per l'esposizione. In una situazione ideale, sarebbe noto il meccanismo di tossicità di ciascuna sostanza chimica dall'esposizione alla manifestazione dell'organismo, in modo tale che le informazioni ottenute dai test in vitro possano essere completamente interpretate e correlate alla risposta dell'intero organismo. Tuttavia, questo è praticamente impossibile, poiché sono stati chiariti relativamente pochi meccanismi tossicologici completi. Pertanto, i tossicologi si trovano di fronte a una situazione in cui i risultati di un test in vitro non possono essere utilizzati come previsione del tutto accurata della tossicità in vivo perché il meccanismo è sconosciuto. Tuttavia, spesso durante il processo di sviluppo di un test in vitro, vengono chiariti i componenti dei meccanismi cellulari e molecolari della tossicità.

Una delle principali questioni irrisolte che circondano lo sviluppo e l'implementazione dei test in vitro è legata alla seguente considerazione: dovrebbero essere basati meccanicamente o è sufficiente che siano descrittivi? È indiscutibilmente meglio da un punto di vista scientifico utilizzare solo test meccanicistici come sostituti dei test in vivo. Tuttavia, in assenza di una conoscenza meccanicistica completa, la prospettiva di sviluppare test in vitro per sostituire completamente i test su animali interi nel prossimo futuro è quasi nulla. Ciò, tuttavia, non esclude l'uso di tipi di test più descrittivi come strumenti di screening precoce, come avviene attualmente. Questi schermi hanno portato a una significativa riduzione dell'uso di animali. Pertanto, fino a quando non verranno generate più informazioni meccanicistiche, potrebbe essere necessario impiegare in misura più limitata test i cui risultati si correlano semplicemente bene con quelli ottenuti in vivo.

Test in vitro per la citotossicità

In questa sezione verranno descritti diversi test in vitro che sono stati sviluppati per valutare il potenziale citotossico di una sostanza chimica. Per la maggior parte, questi test sono facili da eseguire e l'analisi può essere automatizzata. Un test in vitro comunemente usato per la citotossicità è il test del rosso neutro. Questo test viene eseguito su cellule in coltura e, per la maggior parte delle applicazioni, le cellule possono essere mantenute in piastre di coltura che contengono 96 piccoli pozzetti, ciascuno di 6.4 mm di diametro. Poiché ciascun pozzetto può essere utilizzato per una singola determinazione, questa disposizione può contenere più concentrazioni della sostanza chimica in esame nonché controlli positivi e negativi con un numero sufficiente di repliche per ciascuno. Dopo il trattamento delle cellule con varie concentrazioni della sostanza chimica in esame comprese in almeno due ordini di grandezza (ad esempio, da 0.01 mM a 1 mM), nonché sostanze chimiche di controllo positive e negative, le cellule vengono risciacquate e trattate con rosso neutro, un colorante che può essere assorbito e trattenuto solo dalle cellule vive. Il colorante può essere aggiunto alla rimozione della sostanza chimica in esame per determinare gli effetti immediati, oppure può essere aggiunto in momenti diversi dopo la rimozione della sostanza chimica in esame per determinare effetti cumulativi o ritardati. L'intensità del colore in ogni pozzetto corrisponde al numero di cellule vive in quel pozzetto. L'intensità del colore è misurata da uno spettrofotometro che può essere dotato di un lettore di lastre. Il lettore di piastre è programmato per fornire misurazioni individuali per ciascuno dei 96 pozzetti della piastra di coltura. Questa metodologia automatizzata consente allo sperimentatore di eseguire rapidamente un esperimento concentrazione-risposta e di ottenere dati statisticamente utili.

Un altro test relativamente semplice per la citotossicità è il test MTT. MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro) è un colorante tetrazolio che viene ridotto dagli enzimi mitocondriali a un colore blu. Solo le cellule con mitocondri vitali manterranno la capacità di eseguire questa reazione; pertanto l'intensità del colore è direttamente correlata al grado di integrità mitocondriale. Questo è un test utile per rilevare composti citotossici generali così come quegli agenti che prendono di mira specificamente i mitocondri.

La misurazione dell'attività della lattato deidrogenasi (LDH) viene utilizzata anche come test ad ampio raggio per la citotossicità. Questo enzima è normalmente presente nel citoplasma delle cellule viventi e viene rilasciato nel mezzo di coltura cellulare attraverso membrane cellulari che perdono di cellule morte o morenti che sono state influenzate negativamente da un agente tossico. Piccole quantità di terreno di coltura possono essere rimosse in vari momenti dopo il trattamento chimico delle cellule per misurare la quantità di LDH rilasciata e determinare un andamento temporale della tossicità. Sebbene il test di rilascio di LDH sia una valutazione molto generale della citotossicità, è utile perché è facile da eseguire e può essere eseguito in tempo reale.

Ci sono molti nuovi metodi in fase di sviluppo per rilevare il danno cellulare. Metodi più sofisticati impiegano sonde fluorescenti per misurare una varietà di parametri intracellulari, come il rilascio di calcio e le variazioni del pH e del potenziale di membrana. In generale, queste sonde sono molto sensibili e possono rilevare cambiamenti cellulari più sottili, riducendo così la necessità di utilizzare la morte cellulare come endpoint. Inoltre, molti di questi saggi fluorescenti possono essere automatizzati mediante l'uso di piastre a 96 pozzetti e lettori di piastre fluorescenti.

Una volta raccolti i dati su una serie di sostanze chimiche utilizzando uno di questi test, è possibile determinare le relative tossicità. La tossicità relativa di una sostanza chimica, determinata in un test in vitro, può essere espressa come la concentrazione che esercita un effetto del 50% sulla risposta finale delle cellule non trattate. Questa determinazione è indicata come CE₅₀ (Effective Cconcentrazione per 50% delle cellule) e può essere utilizzato per confrontare le tossicità di diverse sostanze chimiche in vitro. (Un termine simile utilizzato per valutare la tossicità relativa è IC₅₀, che indica la concentrazione di una sostanza chimica che provoca un'inibizione del 50% di un processo cellulare, ad esempio la capacità di assorbire il rosso neutro.) Non è facile valutare se la relativa tossicità in vitro delle sostanze chimiche sia paragonabile alla loro relativa tossicità in vivo, poiché ci sono così tanti fattori di confusione nel sistema in vivo, come la tossicocinetica, il metabolismo, i meccanismi di riparazione e difesa. Inoltre, poiché la maggior parte di questi test misura gli endpoint generali di citotossicità, non sono basati meccanicamente. Pertanto, l'accordo tra tossicità relative in vitro e in vivo è semplicemente correlativo. Nonostante le numerose complessità e difficoltà di estrapolazione da in vitro a in vivo, questi test in vitro si stanno rivelando molto preziosi perché sono semplici e poco costosi da eseguire e possono essere utilizzati come screening per segnalare farmaci o sostanze chimiche altamente tossiche nelle prime fasi di sviluppo.

Tossicità per gli organi bersaglio

I test in vitro possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità specifica per organi bersaglio. Ci sono una serie di difficoltà associate alla progettazione di tali test, la più notevole è l'incapacità dei sistemi in vitro di mantenere molte delle caratteristiche dell'organo in vivo. Spesso, quando le cellule vengono prelevate da animali e poste in coltura, tendono a degenerare rapidamente e/oa dedifferenziarsi, cioè a perdere le loro funzioni organiche ea diventare più generiche. Ciò presenta un problema in quanto entro un breve periodo di tempo, di solito pochi giorni, le colture non sono più utili per valutare gli effetti organo-specifici di una tossina.

Molti di questi problemi vengono superati grazie ai recenti progressi nella biologia molecolare e cellulare. Le informazioni ottenute sull'ambiente cellulare in vivo possono essere utilizzate nella modulazione delle condizioni di coltura in vitro. Dalla metà degli anni '1980 sono stati scoperti nuovi fattori di crescita e citochine, e molti di questi sono ora disponibili in commercio. L'aggiunta di questi fattori alle cellule in coltura aiuta a preservarne l'integrità e può anche aiutare a mantenere funzioni più differenziate per periodi di tempo più lunghi. Altri studi di base hanno accresciuto la conoscenza dei fabbisogni nutrizionali e ormonali delle cellule in coltura, così da poter formulare nuovi terreni. Sono stati compiuti recenti progressi anche nell'identificazione di matrici extracellulari sia naturali che artificiali su cui le cellule possono essere coltivate. La coltura di cellule su queste diverse matrici può avere effetti profondi sia sulla loro struttura che sulla loro funzione. Un grande vantaggio derivato da questa conoscenza è la capacità di controllare in modo complesso l'ambiente delle cellule in coltura ed esaminare individualmente gli effetti di questi fattori sui processi cellulari di base e sulle loro risposte a diversi agenti chimici. In breve, questi sistemi possono fornire una visione approfondita dei meccanismi di tossicità specifici degli organi.

Molti studi sulla tossicità degli organi bersaglio sono condotti su cellule primarie, che per definizione sono appena isolate da un organo e di solito mostrano una durata limitata in coltura. Ci sono molti vantaggi nell'avere colture primarie di un singolo tipo cellulare da un organo per la valutazione della tossicità. Da una prospettiva meccanicistica, tali colture sono utili per studiare specifici bersagli cellulari di una sostanza chimica. In alcuni casi, due o più tipi di cellule di un organo possono essere coltivati ​​insieme, e questo fornisce un ulteriore vantaggio di poter osservare le interazioni cellula-cellula in risposta a una tossina. Alcuni sistemi di co-coltura per la pelle sono stati progettati in modo da formare una struttura tridimensionale simile alla pelle in vivo. È anche possibile co-coltivare cellule di organi diversi, ad esempio fegato e reni. Questo tipo di coltura sarebbe utile per valutare gli effetti specifici sulle cellule renali, di una sostanza chimica che deve essere bioattivata nel fegato.

Anche gli strumenti biologici molecolari hanno svolto un ruolo importante nello sviluppo di linee cellulari continue che possono essere utili per i test di tossicità degli organi bersaglio. Queste linee cellulari sono generate trasfettando il DNA in cellule primarie. Nella procedura di trasfezione, le cellule e il DNA vengono trattati in modo tale che il DNA possa essere assorbito dalle cellule. Il DNA di solito proviene da un virus e contiene uno o più geni che, quando espressi, consentono alle cellule di diventare immortali (cioè in grado di vivere e crescere per lunghi periodi di tempo in coltura). Il DNA può anche essere ingegnerizzato in modo che il gene immortalizzante sia controllato da un promotore inducibile. Il vantaggio di questo tipo di costrutto è che le cellule si dividono solo quando ricevono lo stimolo chimico appropriato per consentire l'espressione del gene immortalizzante. Un esempio di tale costrutto è il grande gene dell'antigene T del Simian Virus 40 (SV40) (il gene immortalizzante), preceduto dalla regione del promotore del gene della metallotioneina, che è indotto dalla presenza di un metallo nel mezzo di coltura. Pertanto, dopo che il gene è stato trasfettato nelle cellule, le cellule possono essere trattate con basse concentrazioni di zinco per stimolare il promotore MT e attivare l'espressione del gene dell'antigene T. In queste condizioni, le cellule proliferano. Quando lo zinco viene rimosso dal mezzo, le cellule smettono di dividersi e in condizioni ideali ritornano a uno stato in cui esprimono le loro funzioni tessuto-specifiche.

La capacità di generare cellule immortalizzate combinata con i progressi nella tecnologia delle colture cellulari ha contribuito notevolmente alla creazione di linee cellulari da molti organi diversi, tra cui cervello, reni e fegato. Tuttavia, prima che queste linee cellulari possano essere utilizzate come surrogato per i tipi di cellule in buona fede, devono essere caratterizzate attentamente per determinare quanto siano realmente "normali".

Altri sistemi in vitro per lo studio della tossicità degli organi bersaglio comportano una crescente complessità. Man mano che i sistemi in vitro progrediscono in complessità dalla singola cellula alla coltura dell'intero organo, diventano più paragonabili all'ambiente in vivo, ma allo stesso tempo diventano molto più difficili da controllare dato l'aumento del numero di variabili. Pertanto, ciò che può essere guadagnato nel passaggio a un livello superiore di organizzazione può essere perso nell'incapacità del ricercatore di controllare l'ambiente sperimentale. La tabella 1 confronta alcune delle caratteristiche di vari sistemi in vitro che sono stati utilizzati per studiare l'epatotossicità.

Tabella 1. Confronto dei sistemi in vitro per gli studi di epatotossicità

Le fette di tessuto tagliate con precisione vengono utilizzate più ampiamente per gli studi tossicologici. Sono disponibili nuovi strumenti che consentono al ricercatore di tagliare fette di tessuto uniforme in un ambiente sterile. Le fette di tessuto offrono qualche vantaggio rispetto ai sistemi di coltura cellulare in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule dell'organo e mantengono la loro architettura in vivo e la comunicazione intercellulare. Pertanto, possono essere condotti studi in vitro per determinare il tipo di cellula bersaglio all'interno di un organo nonché per studiare la tossicità specifica dell'organo bersaglio. Uno svantaggio delle fettine è che degenerano rapidamente dopo le prime 24 ore di coltura, principalmente a causa della scarsa diffusione dell'ossigeno alle cellule all'interno delle fettine. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che è possibile ottenere un'aerazione più efficiente mediante una leggera rotazione. Questo, insieme all'uso di un mezzo più complesso, consente alle fette di sopravvivere fino a 96 ore.

Gli espianti di tessuto sono simili nel concetto alle fette di tessuto e possono anche essere utilizzati per determinare la tossicità delle sostanze chimiche in specifici organi bersaglio. Gli espianti di tessuto vengono stabiliti rimuovendo un piccolo frammento di tessuto (per gli studi di teratogenicità, un embrione intatto) e ponendolo in coltura per ulteriori studi. Le colture di espianti sono state utili per studi di tossicità a breve termine, tra cui irritazione e corrosività nella pelle, studi sull'amianto nella trachea e studi di neurotossicità nel tessuto cerebrale.

Gli organi perfusi isolati possono anche essere utilizzati per valutare la tossicità dell'organo bersaglio. Questi sistemi offrono un vantaggio simile a quello delle fette di tessuto e degli espianti in quanto sono presenti tutti i tipi di cellule, ma senza lo stress al tessuto introdotto dalle manipolazioni coinvolte nella preparazione delle fette. Inoltre, consentono il mantenimento delle interazioni intra-organo. Uno dei principali svantaggi è la loro fattibilità a breve termine, che ne limita l'uso per i test di tossicità in vitro. In termini di servizio come alternativa, queste colture possono essere considerate un perfezionamento poiché gli animali non subiscono le conseguenze negative del trattamento in vivo con sostanze tossiche. Tuttavia, il loro uso non riduce significativamente il numero di animali richiesti.

In sintesi, sono disponibili diversi tipi di sistemi in vitro per valutare la tossicità degli organi bersaglio. È possibile acquisire molte informazioni sui meccanismi di tossicità utilizzando una o più di queste tecniche. La difficoltà rimane nel saper estrapolare da un sistema in vitro, che rappresenta una parte relativamente piccola del processo tossicologico, all'intero processo che avviene in vivo.

Test in vitro per l'irritazione oculare

Forse il test di tossicità su animali interi più controverso dal punto di vista del benessere degli animali è il test di Draize per l'irritazione oculare, condotto sui conigli. In questo test, una piccola dose fissa di una sostanza chimica viene posta in uno degli occhi del coniglio mentre l'altro occhio viene utilizzato come controllo. Il grado di irritazione e infiammazione viene misurato in vari momenti dopo l'esposizione. Si sta facendo un grande sforzo per sviluppare metodologie per sostituire questo test, che è stato criticato non solo per ragioni umane, ma anche per la soggettività delle osservazioni e la variabilità dei risultati. È interessante notare che, nonostante le dure critiche che il test di Draize ha ricevuto, ha dimostrato di avere un notevole successo nel predire gli irritanti per l'occhio umano, in particolare le sostanze leggermente o moderatamente irritanti, che sono difficili da identificare con altri metodi. Pertanto, le richieste di alternative in vitro sono elevate.

La ricerca di alternative al test di Draize è complicata, anche se si prevede che avrà successo. Sono state sviluppate numerose alternative in vitro e di altro tipo e in alcuni casi sono state implementate. Le alternative di raffinamento al test di Draize, che per definizione sono meno dolorose o angoscianti per gli animali, includono il Low Volume Eye Test, in cui piccole quantità di materiali di prova vengono poste negli occhi dei conigli, non solo per ragioni umane, ma per imitare più da vicino le quantità a cui le persone possono essere effettivamente esposte accidentalmente. Un altro perfezionamento è che le sostanze che hanno un pH inferiore a 2 o superiore a 11.5 non vengono più testate sugli animali poiché sono note per essere gravemente irritanti per gli occhi.

Tra il 1980 e il 1989, è stato stimato un calo dell'87% nel numero di conigli utilizzati per i test di irritazione oculare dei cosmetici. I test in vitro sono stati incorporati come parte di un approccio di test di livello per realizzare questa vasta riduzione dei test su animali interi. Questo approccio è un processo in più fasi che inizia con un esame approfondito dei dati storici sull'irritazione oculare e l'analisi fisica e chimica della sostanza chimica da valutare. Se questi due processi non forniscono informazioni sufficienti, viene eseguita una batteria di test in vitro. I dati aggiuntivi ottenuti dai test in vitro potrebbero quindi essere sufficienti per valutare la sicurezza della sostanza. In caso contrario, il passaggio finale consisterebbe nell'eseguire test in vivo limitati. È facile vedere come questo approccio possa eliminare o almeno ridurre drasticamente il numero di animali necessari per prevedere la sicurezza di una sostanza sperimentale.

La batteria di test in vitro utilizzata come parte di questa strategia di test di livello dipende dalle esigenze del settore specifico. I test di irritazione oculare vengono eseguiti da un'ampia varietà di industrie, dai cosmetici ai prodotti farmaceutici ai prodotti chimici industriali. Il tipo di informazioni richieste da ciascun settore varia e pertanto non è possibile definire un'unica batteria di test in vitro. Una batteria di test è generalmente progettata per valutare cinque parametri: citotossicità, cambiamenti nella fisiologia e biochimica dei tessuti, relazioni quantitative struttura-attività, mediatori dell'infiammazione e recupero e riparazione. Un esempio di test per la citotossicità, che è una possibile causa di irritazione, è il test del rosso neutro che utilizza cellule in coltura (vedi sopra). I cambiamenti nella fisiologia cellulare e nella biochimica risultanti dall'esposizione a una sostanza chimica possono essere analizzati in colture di cellule epiteliali corneali umane. In alternativa, gli investigatori hanno utilizzato anche bulbi oculari di bovini o di pollo intatti o sezionati ottenuti dai macelli. Molti degli endpoint misurati in queste colture di organi interi sono gli stessi di quelli misurati in vivo, come l'opacità corneale e il gonfiore corneale.

L'infiammazione è spesso una componente della lesione oculare indotta da sostanze chimiche e sono disponibili numerosi test per esaminare questo parametro. Vari saggi biochimici rilevano la presenza di mediatori rilasciati durante il processo infiammatorio come l'acido arachidonico e le citochine. Anche la membrana corioallantoidea (CAM) dell'uovo di gallina può essere utilizzata come indicatore di infiammazione. Nel saggio CAM, un piccolo pezzo del guscio di un embrione di pulcino da dieci a 14 giorni viene rimosso per esporre il CAM. La sostanza chimica viene quindi applicata alla CAM e i segni di infiammazione, come l'emorragia vascolare, vengono segnati in vari momenti successivi.

Uno dei processi in vivo più difficili da valutare in vitro è il recupero e la riparazione del danno oculare. Uno strumento di nuova concezione, il microfisiometro al silicio, misura piccoli cambiamenti nel pH extracellulare e può essere utilizzato per monitorare le cellule in coltura in tempo reale. Questa analisi ha dimostrato di correlare abbastanza bene con il recupero in vivo ed è stata utilizzata come test in vitro per questo processo. Questa è stata una breve panoramica dei tipi di test utilizzati come alternative al test di Draize per l'irritazione oculare. È probabile che nei prossimi anni venga definita una serie completa di batterie di test in vitro e ciascuna sarà convalidata per il suo scopo specifico.

Convalida

La chiave per l'accettazione normativa e l'implementazione delle metodologie di test in vitro è la convalida, il processo mediante il quale viene stabilita la credibilità di un test candidato per uno scopo specifico. Gli sforzi per definire e coordinare il processo di convalida sono stati compiuti sia negli Stati Uniti che in Europa. L'Unione Europea ha istituito il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) nel 1993 per coordinare gli sforzi e per interagire con organizzazioni americane come il Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), un centro accademico negli Stati Uniti e il Comitato di coordinamento interagenzia per la convalida di metodi alternativi (ICCVAM), composto da rappresentanti del National Institutes of Health, dell'Agenzia statunitense per la protezione dell'ambiente, della Food and Drug Administration statunitense e della Commissione per la sicurezza dei prodotti di consumo.

La convalida dei test in vitro richiede un'organizzazione e una pianificazione sostanziali. Deve esserci consenso tra le autorità di regolamentazione del governo e gli scienziati industriali e accademici su procedure accettabili e una supervisione sufficiente da parte di un comitato consultivo scientifico per garantire che i protocolli soddisfino gli standard stabiliti. Gli studi di convalida dovrebbero essere eseguiti in una serie di laboratori di riferimento utilizzando serie calibrate di sostanze chimiche provenienti da una banca chimica e cellule o tessuti provenienti da un'unica fonte. Sia la ripetibilità intralaboratorio che la riproducibilità interlaboratorio di una prova candidata devono essere dimostrate ei risultati devono essere sottoposti ad un'analisi statistica appropriata. Una volta raccolti i risultati delle diverse componenti degli studi di convalida, il comitato consultivo scientifico può formulare raccomandazioni sulla validità del/i test candidato/i per uno scopo specifico. Inoltre, i risultati degli studi dovrebbero essere pubblicati su riviste peer-reviewed e inseriti in un database.

La definizione del processo di validazione è attualmente un work in progress. Ogni nuovo studio di validazione fornirà informazioni utili alla progettazione dello studio successivo. La comunicazione e la cooperazione internazionale sono essenziali per il rapido sviluppo di una serie di protocolli ampiamente accettabili, in particolare data la maggiore urgenza imposta dall'approvazione della direttiva CE sui cosmetici. Questa legislazione può effettivamente fornire lo slancio necessario per intraprendere un serio sforzo di convalida. È solo attraverso il completamento di questo processo che può iniziare l'accettazione dei metodi in vitro da parte delle varie comunità di regolamentazione.

Conclusione

Questo articolo ha fornito un'ampia panoramica dello stato attuale dei test di tossicità in vitro. La scienza della tossicologia in vitro è relativamente giovane, ma sta crescendo in modo esponenziale. La sfida per gli anni a venire è incorporare la conoscenza meccanicistica generata dagli studi cellulari e molecolari nel vasto inventario di dati in vivo per fornire una descrizione più completa dei meccanismi tossicologici e stabilire un paradigma con cui i dati in vitro possono essere utilizzati prevedere la tossicità in vivo. Sarà solo attraverso gli sforzi concertati dei tossicologi e dei rappresentanti del governo che si potrà realizzare il valore intrinseco di questi metodi in vitro.

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