A avaliação da toxicidade genética é a avaliação dos agentes quanto à sua capacidade de induzir qualquer um dos três tipos gerais de alterações (mutações) no material genético (DNA): gene, cromossômico e genômico. Em organismos como os humanos, os genes são compostos de DNA, que consiste em unidades individuais chamadas bases de nucleotídeos. Os genes são arranjados em estruturas físicas discretas chamadas cromossomos. A genotoxicidade pode resultar em efeitos significativos e irreversíveis na saúde humana. O dano genotóxico é um passo crítico na indução do câncer e também pode estar envolvido na indução de defeitos congênitos e morte fetal. As três classes de mutações mencionadas acima podem ocorrer dentro de qualquer um dos dois tipos de tecidos possuídos por organismos como os humanos: esperma ou óvulos (células germinativas) e o tecido remanescente (células somáticas).
Os ensaios que medem a mutação genética são aqueles que detectam a substituição, adição ou deleção de nucleotídeos dentro de um gene. Os ensaios que medem a mutação cromossômica são aqueles que detectam quebras ou rearranjos cromossômicos envolvendo um ou mais cromossomos. Os ensaios que medem a mutação genômica são aqueles que detectam alterações no número de cromossomos, uma condição chamada aneuploidia. A avaliação da toxicidade genética mudou consideravelmente desde o desenvolvimento por Herman Muller em 1927 do primeiro ensaio para detectar agentes genotóxicos (mutagênicos). Desde então, foram desenvolvidos mais de 200 ensaios que medem mutações no DNA; no entanto, menos de dez ensaios são comumente usados atualmente para avaliação de toxicidade genética. Este artigo analisa esses ensaios, descreve o que eles medem e explora o papel desses ensaios na avaliação de toxicidade.
Identificação de Riscos de Câncer Antes do Desenvolvimento do Campo da Toxicologia Genética
A toxicologia genética tornou-se parte integrante do processo geral de avaliação de risco e ganhou estatura nos últimos tempos como um preditor confiável para atividade carcinogênica. No entanto, antes do desenvolvimento da toxicologia genética (antes de 1970), outros métodos foram e ainda estão sendo usados para identificar riscos potenciais de câncer para os seres humanos. Existem seis categorias principais de métodos atualmente usados para identificar riscos de câncer humano: estudos epidemiológicos, bioensaios in vivo de longo prazo, bioensaios in vivo de médio prazo, bioensaios in vivo e in vitro de curto prazo, inteligência artificial (estrutura-atividade), e inferência baseada em mecanismo.
A Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens desses métodos.
Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos métodos atuais para identificar riscos de câncer humano
| Vantagens | Desvantagens | |
| Estudos epidemiológicos | (1) os seres humanos são indicadores definitivos de doenças; (2) avaliar populações sensíveis ou suscetíveis; (3) coortes de exposição ocupacional; (4) alertas sentinelas ambientais |
(1) geralmente retrospectivo (certidões de óbito, vieses de memória, etc.); (2) insensível, caro, demorado; (3) dados de exposição confiáveis às vezes indisponíveis ou difíceis de obter; (4) exposições combinadas, múltiplas e complexas; falta de coortes de controle apropriadas; (5) experimentos em humanos não realizados; (6) detecção de câncer, não prevenção |
| Bioensaios in vivo de longa duração | (1) avaliações prospectivas e retrospectivas (validação); (2) excelente correlação com carcinógenos humanos identificados; (3) níveis de exposição e condições conhecidas; (4) identifica efeitos de toxicidade química e carcinogenicidade; (5) resultados obtidos de forma relativamente rápida; (6) comparações qualitativas entre classes químicas; (7) sistemas biológicos integrados e interativos intimamente relacionados aos humanos | (1) raramente replicado, uso intensivo de recursos; (3) instalações limitadas adequadas para tais experimentos; (4) debate sobre extrapolação de espécies; (5) as exposições usadas são frequentemente em níveis muito superiores aos experimentados por humanos; (6) a exposição a um único produto químico não imita as exposições humanas, que geralmente são a vários produtos químicos simultaneamente |
| Bioensaios in vivo e in vitro de médio e curto prazo | (1) mais rápido e menos dispendioso do que outros ensaios; (2) grandes amostras que são facilmente reproduzíveis; (3) pontos finais biologicamente significativos são medidos (mutação, etc.); (4) podem ser usados como ensaios de triagem para selecionar produtos químicos para bioensaios de longo prazo |
(1) in vitro não prediz totalmente in vivo; (2) geralmente organismo ou órgão específico; (3) potências não comparáveis a animais inteiros ou humanos |
| Associações estrutura química-atividade biológica | (1) relativamente fácil, rápido e barato; (2) confiável para certas classes químicas (por exemplo, nitrosaminas e corantes de benzidina); (3) desenvolvido a partir de dados biológicos, mas não dependente de experimentação biológica adicional | (1) não “biológica”; (2) muitas exceções às regras formuladas; (3) retrospectivo e raramente (mas se tornando) prospectivo |
| Inferências baseadas em mecanismos | (1) razoavelmente preciso para certas classes de produtos químicos; (2) permite refinamentos de hipóteses; (3) pode orientar avaliações de risco para populações sensíveis | (1) mecanismos de carcinogênese química indefinidos, múltiplos e provavelmente químicos ou específicos de classe; (2) pode deixar de destacar exceções aos mecanismos gerais |
Justificativa e Base Conceitual para Ensaios de Toxicologia Genética
Embora os tipos e números exatos de ensaios usados para avaliação de toxicidade genética estejam em constante evolução e variem de país para país, os mais comuns incluem ensaios para (1) mutação genética em bactérias e/ou células de mamíferos cultivadas e (2) mutação cromossômica em células de mamíferos cultivadas e/ou medula óssea em camundongos vivos. Alguns dos ensaios dentro desta segunda categoria também podem detectar aneuploidia. Embora esses ensaios não detectem mutações em células germinativas, eles são usados principalmente devido ao custo extra e à complexidade da realização de ensaios de células germinativas. No entanto, ensaios de células germinativas em camundongos são usados quando informações sobre os efeitos das células germinativas são desejadas.
Estudos sistemáticos durante um período de 25 anos (1970-1995), especialmente no Programa Nacional de Toxicologia dos EUA na Carolina do Norte, resultaram no uso de um número discreto de ensaios para detectar a atividade mutagênica dos agentes. A justificativa para avaliar a utilidade dos ensaios foi baseada em sua capacidade de detectar agentes que causam câncer em roedores e que são suspeitos de causar câncer em humanos (ou seja, carcinógenos). Isso ocorre porque estudos durante as últimas décadas indicaram que as células cancerígenas contêm mutações em certos genes e que muitos carcinógenos também são mutagênicos. Assim, as células cancerígenas são vistas como contendo mutações de células somáticas, e a carcinogênese é vista como um tipo de mutagênese de células somáticas.
Os ensaios de toxicidade genética usados mais comumente hoje foram selecionados não apenas por causa de seu grande banco de dados, custo relativamente baixo e facilidade de desempenho, mas porque demonstraram detectar muitos carcinógenos de roedores e, presumivelmente, humanos. Consequentemente, os ensaios de toxicidade genética são usados para prever a potencial carcinogenicidade dos agentes.
Um importante desenvolvimento conceitual e prático no campo da toxicologia genética foi o reconhecimento de que muitos carcinógenos foram modificados por enzimas dentro do corpo, criando formas alteradas (metabólitos) que frequentemente eram a forma carcinogênica e mutagênica definitiva do produto químico original. Para duplicar esse metabolismo em uma placa de Petri, Heinrich Malling mostrou que a inclusão de uma preparação de fígado de roedor continha muitas das enzimas necessárias para realizar essa conversão ou ativação metabólica. Assim, muitos ensaios de toxicidade genética realizados em placas ou tubos (in vitro) empregam a adição de preparações enzimáticas semelhantes. As preparações simples são chamadas de mistura S9 e as preparações purificadas são chamadas de microssomos. Algumas células bacterianas e de mamíferos já foram geneticamente modificadas para conter alguns dos genes de roedores ou humanos que produzem essas enzimas, reduzindo a necessidade de adicionar mistura S9 ou microssomos.
Ensaios e Técnicas de Toxicologia Genética
Os sistemas bacterianos primários usados para triagem de toxicidade genética são o ensaio de mutagenicidade de Salmonella (Ames) e, em uma extensão muito menor, a cepa WP2 de Escherichia coli. Estudos em meados da década de 1980 indicaram que o uso de apenas duas cepas do sistema Salmonella (TA98 e TA100) eram suficientes para detectar aproximadamente 90% dos mutagênicos conhecidos de Salmonella. Assim, essas duas cepas são usadas para a maioria dos propósitos de triagem; no entanto, várias outras cepas estão disponíveis para testes mais extensos.
Esses ensaios são realizados de várias maneiras, mas dois procedimentos gerais são os ensaios de incorporação em placa e suspensão líquida. No ensaio de incorporação de placa, as células, o produto químico de teste e (quando desejado) o S9 são adicionados juntos em um ágar liquefeito e despejados na superfície de uma placa de Petri de ágar. O ágar superior endurece em alguns minutos e as placas são incubadas por dois a três dias, após o que as células mutantes cresceram para formar aglomerados visualmente detectáveis de células chamadas colônias, que são então contadas. O meio de ágar contém agentes seletivos ou é composto de ingredientes de forma que apenas as células recém-mutadas irão crescer. O ensaio de incubação líquida é semelhante, exceto que as células, agente de teste e S9 são incubados juntos em líquido que não contém ágar liquefeito e, em seguida, as células são lavadas para remover o agente de teste e S9 e semeadas no ágar.
Mutações em células de mamíferos cultivadas são detectadas principalmente em um dos dois genes: hprt e tk. Semelhante aos ensaios bacterianos, as linhagens de células de mamíferos (desenvolvidas a partir de roedores ou células humanas) são expostas ao agente de teste em placas de cultura de plástico ou tubos e, em seguida, são semeadas em placas de cultura que contêm meio com um agente seletivo que permite apenas o crescimento de células mutantes . Os ensaios usados para esse fim incluem o CHO/HPRT, o TK6 e o linfoma de camundongo L5178Y/TK+/- ensaios. Outras linhas de células contendo várias mutações de reparo de DNA, bem como contendo alguns genes humanos envolvidos no metabolismo também são usadas. Esses sistemas permitem a recuperação de mutações dentro do gene (mutação gênica), bem como mutações envolvendo regiões do cromossomo que flanqueiam o gene (mutação cromossômica). No entanto, este último tipo de mutação é recuperado em muito maior extensão pelo tk sistemas de genes do que pelos hprt sistemas de genes devido à localização do tk desconfortável.
Semelhante ao ensaio de incubação líquida para mutagenicidade bacteriana, os ensaios de mutagenicidade de células de mamíferos geralmente envolvem a exposição das células em placas ou tubos de cultura na presença do agente de teste e S9 por várias horas. As células são então lavadas, cultivadas por mais alguns dias para permitir que os produtos gênicos normais (tipo selvagem) sejam degradados e os produtos gênicos recém-mutados sejam expressos e acumulados, e então eles são semeados em meio contendo um agente seletivo que permite apenas as células mutantes para crescer. Como os ensaios bacterianos, as células mutantes crescem em colônias visualmente detectáveis que são então contadas.
A mutação cromossômica é identificada principalmente por ensaios citogenéticos, que envolvem a exposição de roedores e/ou roedores ou células humanas em placas de cultura a um produto químico de teste, permitindo que uma ou mais divisões celulares ocorram, coloração dos cromossomos e, em seguida, exame visual dos cromossomos através de um microscópio para detectar alterações na estrutura ou no número de cromossomos. Embora uma variedade de parâmetros possa ser examinada, os dois que são atualmente aceitos pelas agências reguladoras como sendo os mais significativos são as aberrações cromossômicas e uma subcategoria chamada micronúcleos.
São necessários treinamento e experiência consideráveis para pontuar as células quanto à presença de aberrações cromossômicas, o que torna esse procedimento caro em termos de tempo e dinheiro. Em contraste, os micronúcleos requerem pouco treinamento e sua detecção pode ser automatizada. Os micronúcleos aparecem como pequenos pontos dentro da célula que são distintos do núcleo, que contém os cromossomos. Os micronúcleos resultam de quebra cromossômica ou de aneuploidia. Devido à facilidade de marcar micronúcleos em comparação com aberrações cromossômicas, e porque estudos recentes indicam que os agentes que induzem aberrações cromossômicas na medula óssea de camundongos vivos geralmente induzem micronúcleos neste tecido, os micronúcleos são agora comumente medidos como uma indicação da capacidade de um agente para induzir mutação cromossômica.
Embora os ensaios de células germinativas sejam usados com muito menos frequência do que os outros ensaios descritos acima, eles são indispensáveis para determinar se um agente representa um risco para as células germinativas, cujas mutações podem levar a efeitos na saúde nas gerações seguintes. Os ensaios de células germinativas mais comumente usados são em camundongos e envolvem sistemas que detectam (1) translocações hereditárias (trocas) entre cromossomos (ensaio de translocação hereditária), (2) genes ou mutações cromossômicas envolvendo genes específicos (visíveis ou bioquímicas de locus específico ensaios) e (3) mutações que afetam a viabilidade (ensaio letal dominante). Tal como acontece com os ensaios de células somáticas, a suposição de trabalho com os ensaios de células germinativas é que os agentes positivos nesses ensaios são presumivelmente mutagênicos em células germinativas humanas.
Situação Atual e Perspectivas Futuras
Estudos recentes indicaram que apenas três informações eram necessárias para detectar aproximadamente 90% de um conjunto de 41 carcinógenos de roedores (ou seja, presumíveis carcinógenos humanos e mutagênicos de células somáticas). Estes incluíram (1) conhecimento da estrutura química do agente, especialmente se ele contiver porções eletrofílicas (consulte a seção sobre relações estrutura-atividade); (2) Dados de mutagenicidade de Salmonella; e (3) dados de um ensaio de toxicidade crônica de 90 dias em roedores (camundongos e ratos). De fato, praticamente todos os carcinógenos humanos declarados pela IARC são detectáveis como mutagênicos usando apenas o ensaio de Salmonella e o ensaio de micronúcleo de medula óssea de camundongo. O uso desses ensaios de mutagenicidade para detectar potenciais carcinógenos humanos é apoiado ainda mais pela constatação de que a maioria dos carcinógenos humanos são carcinógenos em ratos e camundongos (carcinógenos transespécies) e que a maioria dos carcinógenos transespécies são mutagênicos em Salmonella e/ou induzem micronúcleos na medula óssea de camundongos.
Com os avanços na tecnologia do DNA, o projeto do genoma humano e uma melhor compreensão do papel da mutação no câncer, estão sendo desenvolvidos novos ensaios de genotoxicidade que provavelmente serão incorporados aos procedimentos de triagem padrão. Entre eles estão o uso de células transgênicas e roedores. Sistemas transgênicos são aqueles em que um gene de outra espécie foi introduzido em uma célula ou organismo. Por exemplo, já estão em uso experimental camundongos transgênicos que permitem a detecção de mutação em qualquer órgão ou tecido do animal, a partir da introdução de um gene bacteriano no camundongo. Células bacterianas, como Salmonella, e células de mamíferos (incluindo linhagens celulares humanas) já estão disponíveis contendo genes envolvidos no metabolismo de agentes carcinogênicos/mutagênicos, como os genes P450. Análise molecular das mutações reais induzidas no gene trans em roedores transgênicos ou em genes nativos, como hprt, ou os genes-alvo dentro da Salmonella podem agora ser realizados, de modo que a natureza exata das mutações induzidas pelos produtos químicos possa ser determinada, fornecendo informações sobre o mecanismo de ação do produto químico e permitindo comparações com mutações em humanos presumivelmente expostos ao agente .
Avanços moleculares em citogenética agora permitem uma avaliação mais detalhada de mutações cromossômicas. Isso inclui o uso de sondas (pequenos pedaços de DNA) que se ligam (hibridizam) a genes específicos. Rearranjos de genes no cromossomo podem então ser revelados pela localização alterada das sondas, que são fluorescentes e facilmente visualizadas como setores coloridos nos cromossomos. O ensaio de eletroforese em gel de célula única para quebra de DNA (comumente chamado de ensaio “cometa”) permite a detecção de quebras de DNA dentro de células individuais e pode se tornar uma ferramenta extremamente útil em combinação com técnicas citogenéticas para detectar danos cromossômicos.
Após muitos anos de uso e a geração de um banco de dados grande e sistematicamente desenvolvido, a avaliação da toxicidade genética pode agora ser feita com apenas alguns ensaios por um custo relativamente pequeno em um curto período de tempo (algumas semanas). Os dados produzidos podem ser usados para prever a capacidade de um agente ser um roedor e, presumivelmente, carcinógeno humano/mutagênico de células somáticas. Esta capacidade permite limitar a introdução no ambiente de agentes mutagénicos e cancerígenos e desenvolver agentes alternativos não mutagénicos. Estudos futuros devem levar a métodos ainda melhores com maior previsibilidade do que os ensaios atuais.