Појава софистицираних технологија у молекуларној и ћелијској биологији подстакла је релативно брзу еволуцију у наукама о животу, укључујући токсикологију. У ствари, фокус токсикологије се помера са целих животиња и популације целих животиња на ћелије и молекуле појединачних животиња и људи. Од средине 1980-их, токсиколози су почели да користе ове нове методологије у процени ефеката хемикалија на живе системе. Као логичан напредак, такве методе се прилагођавају за потребе испитивања токсичности. Ова научна достигнућа су радила заједно са друштвеним и економским факторима како би утицала на промену у процени безбедности производа и потенцијалног ризика.

Економски фактори су посебно повезани са запремином материјала који се мора тестирати. Сваке године на тржиште се уводи мноштво нових козметичких, фармацеутских, пестицида, хемикалија и производа за домаћинство. Сви ови производи морају бити процењени на њихову потенцијалну токсичност. Поред тога, постоји заостатак хемикалија које су већ у употреби које нису адекватно тестиране. Огроман задатак добијања детаљних безбедносних информација о свим овим хемикалијама коришћењем традиционалних метода испитивања целих животиња био би скуп и у смислу новца и времена, ако би уопште могао да се оствари.

Постоје и друштвена питања која се односе на јавно здравље и безбедност, као и све већа забринутост јавности у вези са употребом животиња за тестирање безбедности производа. Што се тиче безбедности људи, групе за јавни интерес и заштиту животне средине извршиле су значајан притисак на владине агенције да примењују строже прописе о хемикалијама. Недавни пример овога је покрет неких еколошких група за забрану хлора и једињења која садрже хлор у Сједињеним Државама. Једна од мотивација за тако екстремну акцију лежи у чињеници да већина ових једињења никада није била адекватно испитана. Из токсиколошке перспективе, концепт забране читаве класе различитих хемикалија заснованих само на присуству хлора је и научно неисправан и неодговоран. Ипак, разумљиво је да из перспективе јавности мора постојати извесна гаранција да хемикалије које се испуштају у животну средину не представљају значајан ризик по здравље. Таква ситуација наглашава потребу за ефикаснијим и бржим методама за процену токсичности.

Друга друштвена брига која је утицала на област испитивања токсичности је добробит животиња. Све већи број група за заштиту животиња широм света изразио је значајно противљење употреби целих животиња за тестирање безбедности производа. Активне кампање вођене су против произвођача козметике, производа за домаћинство и личну негу и фармацеутских производа у покушају да се зауставе тестирање на животињама. Такви напори у Европи су резултирали усвајањем Шестог амандмана на Директиву 76/768/ЕЕЦ (Директива о козметици). Последица ове Директиве је да се козметички производи или козметички састојци који су тестирани на животињама после 1. јануара 1998. године не могу пласирати на тржиште Европске уније, осим ако алтернативне методе нису довољно валидиране. Иако ова Директива нема надлежност над продајом таквих производа у Сједињеним Државама или другим земљама, она ће значајно утицати на компаније које имају међународна тржишта која укључују Европу.

Концепт алтернатива, који чини основу за развој тестова, осим оних на целим животињама, дефинисан је са три Rs: Смањење у броју коришћених животиња; пречишћавање протокола тако да животиње доживљавају мање стреса или нелагодности; и замена актуелних тестова на животињама са ин витро тестовима (тј. тестовима који се раде ван живих животиња), компјутерским моделима или тестовима на нижим врстама кичмењака или бескичмењака. Три Rсу представљени у књизи коју су 1959. објавила два британска научника, ВМС Русселл и Рек Бурцх, Принципи хумане експерименталне технике. Расел и Бурч су сматрали да је једини начин на који се могу добити валидни научни резултати кроз хуман третман према животињама и веровали су да треба развити методе како би се смањила употреба животиња и на крају је заменила. Занимљиво је да су принципи које су изнели Расел и Бурч добили мало пажње све до поновног оживљавања покрета за добробит животиња средином 1970-их. Данас концепт троје Rс је веома у првом плану у погледу истраживања, тестирања и образовања.

Укратко, на развој методологија ин витро тестирања утицали су различити фактори који су се приближили током последњих десет до 20 година. Тешко је утврдити да ли би било који од ових фактора сам по себи имао тако дубок утицај на стратегије испитивања токсичности.

Концепт ин витро тестова токсичности

Овај одељак ће се фокусирати искључиво на ин витро методе за процену токсичности, као једну од алтернатива тестирању на целим животињама. Додатне не-животињске алтернативе, као што су компјутерско моделирање и квантитативни односи структуре и активности, разматрају се у другим чланцима овог поглавља.

Ин витро студије се генерално спроводе на животињским или људским ћелијама или ткивима ван тела. Ин витро буквално значи „у стаклу“ и односи се на поступке који се спроводе на живом материјалу или компонентама живог материјала узгајаног у петријевим посудама или у епруветама под дефинисаним условима. Ово се може супротставити студијама ин виво или онима које су спроведене „на живим животињама“. Иако је тешко, ако не и немогуће, пројектовати ефекте хемикалије на сложени организам када су посматрања ограничена на једну врсту ћелија у посуди, ин витро студије такође пружају значајну количину информација о интринзичној токсичности. као ћелијски и молекуларни механизми токсичности. Поред тога, оне нуде многе предности у односу на ин виво студије у томе што су генерално јефтиније и могу се спроводити под више контролисаним условима. Штавише, упркос чињеници да је још увек потребан мали број животиња за добијање ћелија за ин витро културе, ове методе се могу сматрати алтернативама редукције (пошто се користи много мање животиња у поређењу са ин виво студијама) и алтернативама за пречишћавање (јер елиминишу потребу подвргавање животиња штетним токсичним последицама које намећу експерименти ин виво).

Да би се интерпретирали резултати испитивања токсичности ин витро, утврдила њихова потенцијална корисност у процени токсичности и повезали их са укупним токсиколошким процесом ин виво, неопходно је разумети који део токсиколошког процеса се испитује. Цео токсиколошки процес састоји се од догађаја који почињу излагањем организма физичком или хемијском агенсу, напредују кроз ћелијске и молекуларне интеракције и на крају се манифестују у одговору целог организма. Ин витро тестови су генерално ограничени на део токсиколошког процеса који се одвија на ћелијском и молекуларном нивоу. Типови информација које се могу добити из ин витро студија укључују путеве метаболизма, интеракцију активних метаболита са ћелијским и молекуларним циљевима и потенцијално мерљиве токсичне крајње тачке које могу послужити као молекуларни биомаркери за излагање. У идеалној ситуацији, механизам токсичности сваке хемикалије од излагања до манифестације организма био би познат, тако да би се информације добијене ин витро тестовима могле у потпуности тумачити и повезати са одговором целог организма. Међутим, то је практично немогуће, пошто је релативно мало комплетних токсиколошких механизама разјашњено. Дакле, токсиколози су суочени са ситуацијом у којој се резултати ин витро теста не могу користити као потпуно тачно предвиђање ин виво токсичности јер је механизам непознат. Међутим, често се током процеса развоја ин витро теста разјашњавају компоненте ћелијског и молекуларног механизма(а) токсичности.

Једно од кључних нерешених питања у вези са развојем и имплементацијом ин витро тестова односи се на следеће разматрање: да ли они морају бити механички засновани или је довољно да буду дескриптивни? Из научне перспективе несумњиво је боље користити само механичке тестове као замену за ин виво тестове. Међутим, у недостатку потпуног механистичког знања, изгледи за развој ин витро тестова који би у потпуности заменили тестове на животињама у блиској будућности су скоро никакви. Ово, међутим, не искључује употребу дескриптивнијих типова тестова као раних алата за скрининг, што је тренутно случај. Ови екрани су довели до значајног смањења употребе животиња. Стога, све док се не генерише више механичких информација, можда ће бити неопходно применити у ограниченој мери тестове чији резултати једноставно добро корелирају са онима добијеним ин виво.

Ин витро тестови за цитотоксичност

У овом одељку биће описано неколико ин витро тестова који су развијени за процену цитотоксичног потенцијала хемикалије. Углавном, ови тестови су лаки за извођење и анализа се може аутоматизовати. Један који се обично користи ин витро тест за цитотоксичност је неутрални црвени тест. Овај тест се ради на ћелијама у култури, а за већину примена, ћелије се могу одржавати у посудама за културу које садрже 96 малих бунара, сваки пречника 6.4 мм. Пошто сваки бунар може да се користи за једно одређивање, овај распоред може да прихвати више концентрација испитиване хемикалије, као и позитивне и негативне контроле са довољним бројем понављања за сваку. Након третмана ћелија различитим концентрацијама испитиване хемикалије у распону од најмање два реда величине (нпр. од 0.01 мМ до 1 мМ), као и хемикалијама позитивне и негативне контроле, ћелије се испиру и третирају неутралном црвеном бојом, а боја коју могу да усвоје и задрже само живе ћелије. Боја се може додати након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили непосредни ефекти, или се може додати у различито време након уклањања испитиване хемикалије да би се одредили кумулативни или одложени ефекти. Интензитет боје у сваком бунарчићу одговара броју живих ћелија у том бунарчићу. Интензитет боје се мери спектрофотометром који може бити опремљен читачем плоча. Читач плоча је програмиран да обезбеди појединачна мерења за сваки од 96 бунарчића посуде за културу. Ова аутоматизована методологија дозвољава истраживачу да брзо изведе експеримент концентрације и одговора и да добије статистички корисне податке.

Још један релативно једноставан тест за цитотоксичност је МТТ тест. МТТ (3[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолијум бромид) је тетразолијумова боја коју митохондријски ензими редукују у плаву боју. Само ћелије са одрживим митохондријама ће задржати способност да спроведу ову реакцију; стога је интензитет боје директно повезан са степеном интегритета митохондрија. Ово је користан тест за откривање општих цитотоксичних једињења, као и оних агенаса који специфично циљају митохондрије.

Мерење активности лактат дехидрогеназе (ЛДХ) се такође користи као тест широког спектра цитотоксичности. Овај ензим је нормално присутан у цитоплазми живих ћелија и ослобађа се у медијум ћелијске културе кроз ћелијске мембране мртвих или умирућих ћелија које су биле штетно погођене токсичним агенсом. Мале количине медијума за културу могу се уклонити у различитим временима након хемијског третмана ћелија да би се измерила количина ослобођеног ЛДХ и одредио временски ток токсичности. Иако је тест ослобађања ЛДХ веома општа процена цитотоксичности, он је користан јер се лако изводи и може се урадити у реалном времену.

Постоји много нових метода које се развијају за откривање оштећења ћелија. Софистицираније методе користе флуоресцентне сонде за мерење различитих интрацелуларних параметара, као што су ослобађање калцијума и промене пХ и мембранског потенцијала. Генерално, ове сонде су веома осетљиве и могу открити суптилније ћелијске промене, чиме се смањује потреба за коришћењем ћелијске смрти као крајње тачке. Поред тога, многи од ових флуоресцентних тестова могу бити аутоматизовани коришћењем плоча са 96 јажица и читача флуоресцентних плоча.

Када се прикупе подаци о низу хемикалија помоћу једног од ових тестова, може се одредити релативна токсичност. Релативна токсичност хемикалије, утврђена ин витро тестом, може се изразити као концентрација која има 50% ефекта на одговор крајње тачке нетретираних ћелија. Ова одлука се назива ЕК₅₀ (Eефективно Cконцентрација за 50% ћелија) и може се користити за поређење токсичности различитих хемикалија ин витро. (Сличан термин који се користи у процени релативне токсичности је ИЦ₅₀, што указује на концентрацију хемикалије која изазива 50% инхибицију ћелијског процеса, нпр. способност да преузме неутрално црвено.) Није лако проценити да ли је релативна ин витро токсичност хемикалија упоредива са њиховом релативном у виво токсичности, пошто постоји толико збуњујућих фактора у систему ин виво, као што су токсикокинетика, метаболизам, поправка и одбрамбени механизми. Поред тога, пошто већина ових тестова мери опште крајње тачке цитотоксичности, они нису механички засновани. Стога је слагање између ин витро и ин виво релативне токсичности једноставно корелативно. Упркос бројним сложеностима и потешкоћама у екстраполацији са ин витро на ин виво, ови ин витро тестови су се показали веома вредним јер су једноставни и јефтини за извођење и могу се користити као екрани за означавање високо токсичних лекова или хемикалија у раним фазама развој.

Токсичност циљног органа

Ин витро тестови се такође могу користити за процену специфичне токсичности циљног органа. Постоје бројне потешкоће повезане са дизајнирањем таквих тестова, од којих је најзначајнија неспособност ин витро система да одрже многе карактеристике органа ин виво. Често, када се ћелије узму од животиња и ставе у културу, оне имају тенденцију или да брзо дегенеришу и/или да се дедиференцирају, односно изгубе своје функције сличне органу и постану генеричке. Ово представља проблем јер у кратком временском периоду, обично неколико дана, културе више нису корисне за процену ефеката токсина специфичних за органе.

Многи од ових проблема се превазилазе због недавног напретка у молекуларној и ћелијској биологији. Информације које се добију о ћелијском окружењу ин виво могу се користити за модулацију услова културе ин витро. Од средине 1980-их, откривени су нови фактори раста и цитокини, а многи од њих су сада доступни комерцијално. Додавање ових фактора ћелијама у култури помаже у очувању њиховог интегритета и такође може помоћи да се задрже више диференциране функције током дужег временског периода. Друге основне студије су повећале знање о нутритивним и хормонским потребама ћелија у култури, тако да се могу формулисати нови медији. Недавни напредак је такође постигнут у идентификацији природних и вештачких екстрацелуларних матрица на којима се ћелије могу узгајати. Култура ћелија на овим различитим матрицама може имати дубоке ефекте и на њихову структуру и на функцију. Главна предност која произилази из овог знања је способност да се замршено контролише окружење ћелија у култури и појединачно испитају ефекти ових фактора на основне ћелијске процесе и на њихове одговоре на различите хемијске агенсе. Укратко, ови системи могу пружити сјајан увид у механизме токсичности специфичне за органе.

Многе студије токсичности за циљне органе спроводе се у примарним ћелијама, које су по дефиницији свеже изоловане из органа и обично показују ограничен животни век у култури. Постоје многе предности поседовања примарних култура једног типа ћелије из органа за процену токсичности. Из механичке перспективе, такве културе су корисне за проучавање специфичних ћелијских циљева хемикалије. У неким случајевима, два или више типова ћелија из органа могу се култивисати заједно, а ово пружа додатну предност у могућности да се посматрају интеракције ћелија-ћелија као одговор на токсин. Неки системи ко-културе за кожу су конструисани тако да формирају тродимензионалну структуру која личи на кожу ин виво. Такође је могуће заједно култивисати ћелије из различитих органа — на пример, јетре и бубрега. Ова врста културе би била корисна у процени ефеката специфичних за ћелије бубрега, хемикалије која се мора биоактивирати у јетри.

Молекуларно биолошки алати су такође играли важну улогу у развоју континуираних ћелијских линија које могу бити корисне за испитивање токсичности циљних органа. Ове ћелијске линије се генеришу трансфекцијом ДНК у примарне ћелије. У поступку трансфекције, ћелије и ДНК се третирају тако да ДНК могу да преузму ћелије. ДНК је обично од вируса и садржи ген или гене који, када се експримирају, омогућавају ћелијама да постану овековечене (тј. способне да живе и расту у дужем временском периоду у култури). ДНК се такође може конструисати тако да бесмртни ген контролише индуцибилни промотер. Предност ове врсте конструкта је у томе што ће се ћелије поделити само када добију одговарајући хемијски стимуланс који омогућава експресију бесмртног гена. Пример таквог конструкта је велики ген Т антигена из Симиан вируса 40 (СВ40) (ген за бесмртност), коме претходи промоторски регион металотионеинског гена, који је индукован присуством метала у медијуму културе. Дакле, након што је ген трансфектован у ћелије, ћелије се могу третирати ниским концентрацијама цинка да би се стимулисао МТ промотор и укључила експресија гена Т антигена. У овим условима, ћелије се размножавају. Када се цинк уклони из медијума, ћелије престају да се деле и под идеалним условима се враћају у стање у коме изражавају своје функције специфичне за ткиво.

Способност стварања бесмртних ћелија у комбинацији са напретком у технологији ћелијске културе у великој мери је допринела стварању ћелијских линија из многих различитих органа, укључујући мозак, бубреге и јетру. Међутим, пре него што се ове ћелијске линије могу користити као сурогат за веродостојне типове ћелија, морају се пажљиво окарактерисати да би се утврдило колико су „нормалне“ заиста.

Други ин витро системи за проучавање токсичности циљних органа укључују све већу сложеност. Како ин витро системи напредују у сложености од једне ћелије до културе целог органа, они постају све упоредивији са ин виво миљеом, али у исто време постају много тежи за контролу с обзиром на повећан број варијабли. Стога, оно што се може добити преласком на виши ниво организације може се изгубити у неспособности истраживача да контролише експериментално окружење. Табела 1 упоређује неке од карактеристика различитих ин витро система који су коришћени за проучавање хепатотоксичности.

Табела 1. Поређење ин витро система за студије хепатотоксичности

Прецизно исечени комади ткива се више користе за токсиколошке студије. Доступни су нови инструменти који омогућавају истраживачу да сече уједначене резове ткива у стерилном окружењу. Резови ткива нуде одређену предност у односу на системе ћелијске културе јер су присутни сви типови ћелија органа и одржавају своју архитектуру ин виво и међућелијску комуникацију. Стога, ин витро студије могу да се спроведу да би се одредио тип циљне ћелије унутар органа, као и да се испита специфична токсичност за циљни орган. Недостатак резина је што се брзо дегенеришу након прва 24 сата културе, углавном због лоше дифузије кисеоника до ћелија у унутрашњости резова. Међутим, недавне студије су показале да се ефикаснија аерација може постићи благим окретањем. Ово, заједно са употребом сложенијег медијума, омогућава да кришке преживе до 96 сати.

Експлантати ткива су по концепту слични резовима ткива и такође се могу користити за одређивање токсичности хемикалија у одређеним циљним органима. Експлантати ткива се успостављају уклањањем малог комада ткива (за студије тератогености, нетакнути ембрион) и стављањем у културу ради даљег проучавања. Културе експлантата су биле корисне за краткорочне студије токсичности укључујући иритацију и корозивност коже, студије азбеста у трахеји и студије неуротоксичности у можданом ткиву.

Изоловани перфузирани органи се такође могу користити за процену токсичности циљног органа. Ови системи нуде предност сличну оној код резова ткива и експлантата у томе што су присутни сви типови ћелија, али без стреса на ткиво унетог манипулацијама укљученим у припрему резова. Поред тога, омогућавају одржавање интеракција унутар органа. Главни недостатак је њихова краткорочна одрживост, што ограничава њихову употребу за ин витро испитивање токсичности. У смислу служења као алтернатива, ове културе се могу сматрати префињеношћу јер животиње не доживљавају штетне последице ин виво третмана токсичним супстанцама. Међутим, њихова употреба не смањује значајно број потребних животиња.

Укратко, постоји неколико типова ин витро система доступних за процену токсичности циљног органа. Могуће је добити много информација о механизмима токсичности користећи једну или више ових техника. Потешкоћа остаје у знању како да се екстраполира из ин витро система, који представља релативно мали део токсиколошког процеса, на цео процес који се одвија ин виво.

Ин витро тестови за иритацију ока

Можда најспорнији тест токсичности за целе животиње из перспективе добробити животиња је Драизеов тест за иритацију очију, који се спроводи код зечева. У овом тесту, мала фиксна доза хемикалије ставља се у једно око зеца док се друго око користи као контрола. Степен иритације и упале се оцењује у различитим временима након излагања. Улажу се велики напори да се развију методологије које ће заменити овај тест, који је критикован не само из хуманих разлога, већ и због субјективности запажања и варијабилности резултата. Занимљиво је приметити да се упркос оштрим критикама које је Драизеов тест добио, показао да је изузетно успешан у предвиђању иритација људских очију, посебно благо до умерено иритирајућих супстанци, које је тешко идентификовати другим методама. Дакле, захтеви за ин витро алтернативама су велики.

Потрага за алтернативама Драизе тесту је компликована, иако се предвиђа да ће бити успешна. Бројне ин витро и друге алтернативе су развијене иу неким случајевима су спроведене. Алтернативе префињености Драизе тесту, које су по дефиницији мање болне или узнемирујуће за животиње, укључују тест малог волумена очију, у којем се мање количине тест материјала стављају у очи зечева, не само из хуманих разлога, већ и да би ближе опонашају количине којима људи могу бити случајно изложени. Још једно прецизирање је да се супстанце које имају пХ мањи од 2 или већи од 11.5 више не тестирају на животињама јер се зна да су јако иритантне за око.

Између 1980. и 1989. године, процењено је да је број зечева који се користе за тестирање козметике на иритацију очију за 87%. Ин витро тестови су укључени као део нивоа тестирања како би се дошло до овог огромног смањења у тестовима на целим животињама. Овај приступ је процес у више корака који почиње темељним испитивањем историјских података о иритацији ока и физичко-хемијском анализом хемикалије коју треба проценити. Ако ова два процеса не дају довољно информација, онда се врши батерија ин витро тестова. Додатни подаци добијени ин витро тестовима тада могу бити довољни за процену безбедности супстанце. Ако не, онда би последњи корак био извођење ограничених ин виво тестова. Лако је видети како овај приступ може елиминисати или бар драстично смањити број животиња потребних за предвиђање безбедности испитиване супстанце.

Батерија ин витро тестова која се користи као део ове стратегије нивоа тестирања зависи од потреба одређене индустрије. Тестирање иритације очију врши се у разним индустријама, од козметике преко фармацеутских производа до индустријских хемикалија. Врста информација које захтева свака индустрија варира и стога није могуће дефинисати једну батерију ин витро тестова. Тест батерија је генерално дизајнирана да процени пет параметара: цитотоксичност, промене у физиологији и биохемији ткива, квантитативни односи структуре и активности, медијатори упале и опоравак и поправка. Пример теста за цитотоксичност, који је један од могућих узрока иритације, је неутрални црвени тест који користи култивисане ћелије (види горе). Промене у ћелијској физиологији и биохемији које су резултат излагања хемикалијама могу се испитати у културама епителних ћелија рожњаче човека. Алтернативно, истраживачи су такође користили нетакнуте или сециране говеђе или пилеће очне јабучице добијене из кланица. Многе крајње тачке мерене у овим целим културама органа су исте као оне мерене ин виво, као што су замућеност рожњаче и отицање рожњаче.

Упала је често компонента хемикалије изазване повреде ока, а постоји низ тестова који су доступни за испитивање овог параметра. Различити биохемијски тестови откривају присуство медијатора који се ослобађају током инфламаторног процеса, као што су арахидонска киселина и цитокини. Хориоалантоична мембрана (ЦАМ) кокошијег јајета се такође може користити као индикатор упале. У ЦАМ тесту, мали комад љуске пилећег ембриона од десет до 14 дана се уклања да би се открио ЦАМ. Хемикалија се затим примењује на ЦАМ и знаци упале, као што је васкуларно крварење, се бележе у различитим временима након тога.

Један од најтежих ин виво процеса за процену ин витро је опоравак и поправка повреде ока. Новоразвијени инструмент, силицијумски микрофизиометар, мери мале промене у екстрацелуларном пХ и може се користити за праћење култивисаних ћелија у реалном времену. Показало се да ова анализа прилично добро корелира са ин виво опоравком и коришћена је као ин витро тест за овај процес. Ово је био кратак преглед типова тестова који се користе као алтернативе Драизе тесту за иритацију ока. Вероватно је да ће у наредних неколико година бити дефинисана комплетна серија ин витро тест батерија и свака ће бити валидирана за своју специфичну намену.

Валидација

Кључ за регулаторно прихватање и имплементацију методологија ин витро тестирања је валидација, процес којим се утврђује кредибилитет теста кандидата за одређену сврху. Напори да се дефинише и координише процес валидације учињени су иу Сједињеним Државама иу Европи. Европска унија је основала Европски центар за валидацију алтернативних метода (ЕЦВАМ) 1993. године да би координирала напоре тамо и радила у интеракцији са америчким организацијама као што је Џон Хопкинс центар за алтернативе тестирању на животињама (ЦААТ), академски центар у Сједињеним Државама. , и Међуагенцијски координациони комитет за валидацију алтернативних метода (ИЦЦВАМ), састављен од представника Националног института за здравље, Америчке агенције за заштиту животне средине, америчке Управе за храну и лекове и Комисије за безбедност потрошачких производа.

Валидација ин витро тестова захтева значајну организацију и планирање. Мора постојати консензус међу владиним регулаторима и индустријским и академским научницима о прихватљивим процедурама, као и довољан надзор од стране научног саветодавног одбора како би се осигурало да протоколи испуњавају постављене стандарде. Студије валидације треба да се изводе у низу референтних лабораторија користећи калибрисане сетове хемикалија из хемијске банке и ћелије или ткива из једног извора. И унутарлабораторијска поновљивост и међулабораторијска поновљивост теста кандидата морају се показати, а резултати подвргнути одговарајућој статистичкој анализи. Када се сакупе резултати различитих компоненти студија валидације, научни саветодавни одбор може дати препоруке о валидности тестова кандидата за одређену сврху. Поред тога, резултате студија треба објавити у рецензираним часописима и ставити у базу података.

Дефиниција процеса валидације је тренутно у току. Свака нова студија валидације ће пружити информације корисне за дизајн следеће студије. Међународна комуникација и сарадња су од суштинског значаја за брз развој широко прихватљивог низа протокола, посебно имајући у виду повећану хитност коју намеће усвајање Директиве ЕК о козметици. Ово законодавство може заиста пружити потребан подстицај за предузимање озбиљних напора за валидацију. Тек кроз завршетак овог процеса може почети прихватање ин витро метода од стране различитих регулаторних заједница.

Zakljucak

Овај чланак је пружио широк преглед тренутног статуса испитивања токсичности ин витро. Наука о ин витро токсикологији је релативно млада, али експоненцијално расте. Изазов за наредне године је да се механичко знање генерисано ћелијским и молекуларним студијама инкорпорира у огроман ин виво података како би се обезбедио потпунији опис токсиколошких механизама, као и да се успостави парадигма по којој се подаци ин витро могу користити за предвиђање токсичности ин виво. Инхерентна вредност ових ин витро метода ће бити остварена само кроз усаглашене напоре токсиколога и представника владе.

Назад